以LDHA 為靶點的抗癌藥物虛擬篩選

段超杰，王浩臻，高兵(★通信作者)

（1.沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110136）

0 引言

癌癥是20 世紀最可怕的疾病之一。隨著21 世紀癌癥發病率的不斷增加而進一步蔓延，這種情況非常令人擔憂。癌癥是一種代謝性疾病[1]，癌細胞與正常細胞相比，主要生化特征之一是即使在低氧條件下也會發生從氧化磷酸化到糖酵解增加的代謝轉換，這被稱為Warburg 效應[2]。這種對糖酵解的依賴性也使腫瘤缺氧區的細胞具有生長優勢。癌癥代謝中糖酵解異常增加很大程度上取決于失調的代謝酶。大量研究表明，LDHA 與乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、神經母細胞癌、口腔鱗狀上皮癌、前列腺癌等癌癥密切相關[3-9]。LDHA 是在腫瘤細胞的代謝中起關鍵作用的酶[10-14]，通過將丙酮酸轉化為乳酸來促進糖酵解過程,在許多類型的癌癥中表達升高，并于腫瘤的生長，維持和侵襲有關[2]。LDHA 的抑制作用會切斷癌癥的能量和合成代謝效應，從而降低癌細胞的轉移和侵襲潛能[15]。因此該酶被認為是新的抗癌藥物的潛在靶標。

LDHA 是乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)家族中的一員，是由LDH-A 基因編碼的M 亞基組成的四聚體酶，并要與NADH 結合后才可發揮生物學活性。NADH 依賴酶LDHA 介導了當胞漿NADH/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 比率較高時，催化丙酮酸還原為乳酸的氧化還原反應，這是再生NAD+的關鍵步驟，并且需要維持糖酵解以延續癌細胞的存活[16-18]。目前研究發現，一些MicroRNA可通過直接與其3’非翻譯區(3’UTR)結合來抑制LDHA mRNA 表達水平，從而阻礙糖酵解，細胞增殖和侵襲[6,19,20]。除此之外，一些天然化合物被報道對LDHA 活性也存在抑制作用，包括Stiripentol[21]，Machilin A[22]，天然產物棉酚[23]，N-羥基吲哚[15]，衍生物FX-11[24]，它們其中大部分都是通過阻斷LDHA 的NADH 結合位點而成為競爭性抑制劑，可抑制各種癌細胞中的LDHA 活性。

計算機虛擬篩選(Virtual Screening)是藥物開發的重要手段之一,被廣泛應用于現代藥物前期開發。其中分子對接(Molecular Docking)是在經過綜合計算后，預測受體分子和配體分子間的結合方式和結合能力。虛擬篩選依賴有效的藥物靶點和豐富的化合物數據庫。在藥物開發過程中虛擬篩選使用的化合物通常是盡可能涵蓋所有可及的化合物，但該研究的主要目的是尋找具有潛在醫療價值的天然產物，所以將只使用天然產物數據庫。Drug Bank數據庫是一個獨特的生物信息學和化學信息學資源庫，它將詳細的藥物數據與全面的藥物靶點信息結合到一起，為我們提供了豐富的天然產物的資源。

本研究旨在以LDHA 的NADH 結合區為靶點，運用計算機虛擬篩選技術，篩選出一批有效的天然產物，為癌癥救治提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蛋白質晶體結構來自PDB 數據庫(RCSB Protein Date Bank)；天然產物結構來自Drug Bank 數據庫；Auto Dock Tools，Auto Dock Vina 分子對接軟件，PyMol 分子三維結構顯示軟件，深度學習GPU 靜音服務器。

1.2 靶蛋白處理

在蛋白質數據庫網站RCSB 下載人類LDHA 酶的三維結構數據，PDB ID:1I10。用PyMol 與Auto Dock Tools 進行處理，除去多余的分子，將其格式轉換為Pdbqt 格式。最后以NADH 結合區作為對接口袋，利用Grid box 程序生成對接口袋格點文件。

1.3 小分子配體庫的建立

所有化合物的三維結構從Drug Bank 數據庫進行下載，共計7877 種。

1.4 小分子配體庫與受體蛋白的分子對接

將獲取到的所有文件都存放在深度學習GPU 靜音服務器中。以小分子配體為分子探針，根據生成的對接口袋格點文件對處理后的LDHA 受體進行Auto Dock Vina 虛擬篩選。根據對接結果給出的結合能由小到大排序，提取并過濾出活性最佳的化合物。NADH 是LDHA 酶的輔因子，兩者結合后才可發揮生物學活性。選擇NADH 與LDHA 的結合位點作為對接口袋進行虛擬篩選。對接口袋設置為：center(x,y,z)=(19.875,54.312,173.081)，size(x,y,z)=(30,24,22)。

2 結果

2.1 LDHA 晶體結構

LDHA 的三維晶體結構(PDB ID:1I10)從蛋白質數據庫(PDB)下載。用PyMol 去除多余的配體，再用Auto Dock Tools 刪除水分子，加電荷，加氫原子等處理，然后轉換為Pdbqt 格式。經處理后的LDHA 的晶體結構見圖1。

圖1 LDHA 的晶體結構

2.2 天然產物的對接結果

經過Auto Dock vina 首輪的虛擬篩選從7877個化合物中得到了74 個結合能小于-10.0 的化合物。之后，用Auto Dock 對接軟件在74 個化合物中復篩，得到最佳的5 個化合物（表1），包括2'-deoxy-N-(naphthalen-1-ylmethyl) guanosine 5'-(dihydrogen phosphate),MGB-BP-3,Naldemedine,RU85053,2-[4-[(Z)-2-Acetamido-3-oxo-3-[[(3S)-2-oxo-1-[(4-phenylphenyl)methyl]azepan-3-yl]amino]prop-1-enyl]-2-formylphenyl]acetic acid。并將這5 個化合物作進一步分析，化合物結構見圖2。

表1 候選小分子的打分值

2.3 中靶化合物與LDHA 的相互作用模型

針對中靶化合物進行了進一步的分析，得到了5 個化合物與LDHA 的相互作用模型，結果顯示5 個分子均準確地對接到LDHA 的NADH 結合區，并與周圍的等氨基酸形成相互作用，影響了NADH 與ALA29,VAL30,ASP51,ALA97 等氨基酸殘基的疏水作用以及與ARG98,ASN137,HIS192,THR247 等氨基酸殘基的氫鍵結合（圖3）。

圖2 候選化合物的結構

3 討論

LDHA 是機體內一個重要的脫氫酶，與NADH 結合后參與許多重要的生物學過程。在人體組織中有5種活性LDH 同工酶，每一種都是由M 和H 兩個主要亞基組成的四聚體酶，分別由LDH-A 和LDH-B 編碼。骨骼肌以M 亞單位為主，心肌以H 亞單位為主。當A鏈多于B 鏈時，LDH 同工酶在催化丙酮酸轉化為乳酸方面變得更為有效；相反，B 鏈的過量有利于丙酮酸進入檸檬酸循環轉化為乙酰輔酶A[2]。在正常生理條件下，丙酮酸由葡萄糖通過糖酵解生成，并在線粒體中進入檸檬酸循環形成乙酰輔酶A，用于促進氧化磷酸化。然而，當氧氣缺乏時，細胞無法利用氧化磷酸化有效地產生ATP。在這種情況下，糖酵解成為ATP 的主要來源。與正常細胞相比，癌細胞的糖酵解速率增加。LDHA 在調節糖酵解中起著關鍵的作用，它的上調有助于提高腫瘤細胞厭氧糖酵解的效率，降低它們對氧的依賴性，以產生足夠的能量來滿足快速增殖的腫瘤細胞的需求。因此，以LDHA 為靶點，設計研發特異性的LDHA 抑制劑可為癌癥的治療提供新的思路和潛在藥物。目前已經發現LDHA 抑制劑也在癲癇[25]，腎草酸鈣結石[26]等疾病的防治也具有重要作用。虛擬篩選技術是進行創新藥物研究的新技術，由于其高效、快速、經濟等優勢，近年來已經成為一種與高通量篩選互補的藥物篩選技術。目前，虛擬篩選技術已經用于LDHA 抑制劑的研發[27-29]。

本研究以LDHA 的NADH 結合區為靶點,利用Auto Dock Vina 對接軟件對Drug Bank 數據庫7877個化合物進行虛擬篩選，發現了5 個新的高活性LDHA 抑制劑。通過數據庫查詢我們發現中靶化合物MGB-BP-3 與Naldemedine 的藥理學信息。其中，MGB-BP-3正在進行治療艱難梭菌感染的臨床試驗當中。Naldemedine是一種類鴉片受體拮抗劑，可以拮抗阿片類藥物的便秘作用，于2017年在美國和日本被批準用于治療阿片類藥物引起的便秘。筆者的篩選結果可為新的LDHA抑制劑的研發提供有用的信息。隨著虛擬篩選工具的不斷改進，LDHA抑制劑的研發速度必定會大大提高。通過虛擬篩選設計小的類藥物分子來靶向LDHA是可以實現的，并且能夠阻礙腫瘤的生長和維持。然而，虛擬篩選技術僅僅是創新藥物研究的輔助性工具，僅僅考慮受體配體的相互作用，而未考慮藥物復雜的作用機制以及可能存在的毒性作用等問題，所以許多中靶化合物仍然需要進一步的發展來提高其特異性和效力。因此，本研究通過虛擬篩選發現的5個高活性的LDHA抑制劑有待進一步通過實驗驗證其藥理活性及毒性。