益母縮宮顆粒調節藥物流產不全大鼠血管生成調節因子的實驗觀察

李品英，毛惠，黃正迎

（1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院 婦產科，四川 瀘州 646000）

0 引言

藥物流產主要是采用口服米非司酮和米索前列醇來終止妊娠，無痛人流術是在傳統人流手術的基礎上，結合丙泊酚及芬太尼使手術中的患者痛苦減少[1]。藥物流產因其方法簡便、價格低、創傷小，臨床應用廣泛，患者接受度高。但部分患者會出現流產不全，表現為陰道出血時間延長，出血量增多，易造成盆腔感染、月經紊亂、貧血等并發癥[2]。減少藥物流產后異常子宮出血是目前臨床上需要不斷摸索且需解決的問題。

益母縮宮顆粒為我院院內制劑，是由《傅青主女科》生化湯化裁而來，由當歸、川芎、桃仁、炮姜、益母草、枳殼、蒲黃（生）七味中藥組成,，臨床常用于治療產后、人工流產、上環等術后引起的陰道不規則出血。課題組前期研究發現益母縮宮顆粒能明顯縮短藥物流產后陰道流血時間、減少流血量、促進惡露排出、幫助子宮復舊等，有效減少藥物流產后相關并發癥[3-5]。目前關于益母縮宮顆粒對藥物流產后子宮異常出血的作用機制尚不明確。本實驗通過依照王曉東[6]造模法建立藥物流產不全大鼠模型，探討益母縮宮顆粒是否通過調控血管生成調節因子Ang-1、Ang-2、VEGF 的表達來減少藥物流產后子宮異常出血，研究益母縮宮顆粒的作用規律，為本藥的進一步研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物：

SPF 級別SD 大鼠，選用2 月齡健康雄性SD 大鼠25 只，體重（250±20）g，2 月齡健康雌性SD 大鼠60 只，體重（220±20）g。均由西南醫科大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK（川）2018-17。均飼養于西南醫科大學實驗動物中心，許可證號SYXK（川）2018-065。

1.2 實驗藥物與試劑

益母縮宮顆粒（西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室，規格：10g/袋，產品批號20191119）；米非司酮（華潤紫竹藥業有限公司，規格：25mg/片，產品批號432005041）；米索前列醇（華潤紫竹藥業有限公司，規格：0.2mg/片，產品批號43200304）；注射用苯巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業有限公司，規格：0.1g/瓶，產品批號190503）；縮宮素注射液(河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，規格：10IU/支，產品批號:21908013)；大鼠血管內皮細胞生長因子(VEGF)ELISA 試劑盒(貨號：ZC-37412，規格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產)，大鼠促血管生成素-1(Ang-1)ELISA 試劑盒(貨號：ZC-37428，規格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產)，大鼠促血管生成素-2(Ang-2)ELISA 試劑盒(貨號：ZC-37429，規格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生產)。

1.3 主要儀器

計算機，型號，TFT185W80PS，冠捷顯示科技有限公司生產；酶標儀，型號，SpectraMAXPlus384，美谷分子儀器有限公司生產；優普超純水制造系統，型號，UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司生產；電子恒溫水浴鍋，型號DZKW-4，北京中興偉業儀器有限公司生產；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，型號，SYQ-DSX-280B，上海申安醫療器械廠生產；移液槍，規格，1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司生產；槍頭，規格，1000μL、200μL、20μL，美國Axygen 公司生產；EP 管，規格：1.5mL、0.2mL、100μL，美國Axygen 公司生產。

2 實驗方法

2.1 藥物劑量設計

益母縮宮顆粒，大鼠給藥量為1.562g/kg·d，中劑量組3.125g/kg·d，高劑量組6.25g/kg·d；米非司酮，大鼠服藥劑量為8.3mg/kg，將該藥研磨成細粉后加入蒸餾水，灌胃前搖勻；米索前列醇，大鼠服藥劑量為100μg/kg，將該藥研磨成細粉后加入蒸餾水，灌胃前搖勻給藥；以上藥物灌胃時按體積給藥：1mL/100g；縮宮素注射液，大鼠用藥劑量為0.9U/kg/d。

2.2 造模

選擇SPF 級成熟雌性大鼠60 只，雄性大鼠25只，適應性喂養1 周后，隨機挑選10 只未合籠雌性大鼠作為空白組（E 組）。依照王曉東造模法將剩下的50 只雌性SD 大鼠與25 只雄性SD 大鼠按照2：1 比例于每日18 時合籠，次日晨8 時檢查陰栓或陰道涂片，在陰栓或涂片上發現精子者定為妊娠第一天d1，若未受孕，則雌鼠繼續保留，待下次合籠受孕。將成功交配大鼠于妊娠d7 灌胃米非司酮(8.3mg/kg，8 時)和米索前列醇(100ug/kg，18 時)，同時在陰道內置入定量消毒棉球一個，觀察陰道出血情況，d8 清晨8 時檢查大鼠陰道消毒棉球，見血跡提示造模成功。

本次實驗共造模成功48 只雌鼠，將造模成功SD大鼠隨機分為5 組，即模型組（D 組10 只）、益母縮宮顆粒低劑量組（A 組10 只）、益母縮宮顆粒中劑量組（B 組9 只）、益母縮宮顆粒高劑量組（C 組9 只）、縮宮素對照組（F 組10 只）。

益母縮宮顆粒實驗組于妊娠D8 開始每日按高、中、低濃度益母縮宮顆粒灌胃，連續灌胃7 天，每天1 次；模型組及空白組大鼠于妊娠D8 開始每日灌喂動物實驗中心飲用水，連續灌胃7 天，每天1 次；縮宮素對照組于妊娠D8 開始肌肉注射縮宮素，連續注射3 天，每天1 次。

2.3 取材

各組大鼠于妊娠D15 早晨8:00 行全身麻醉（注射用苯巴比妥鈉50mg/kg 腹腔注射）。待麻醉滿意后，以大鼠下腹部正中為切口，沿腹白線縱行切開2～3 厘米；逐層切開皮膚、皮下組織，鈍性分離肌肉，暴露腹腔，找到腹主動脈，迅速取血，離心機分離血清，將血清存放于-80℃冰箱備用。

2.4 血管生成調節因子檢測

采用ELISA 法檢測大鼠血清中血管內皮細胞生長因子（VEGF）、促血管生成素-1(Ang-1) 和促血管生成素-2(Ang-2)水平。

2.5 統計分析

實驗數據資料用SPSS 23.0 進行分析，VEGF、Ang-1 和 Ang-2 數據分布呈正態分布且方差齊，用“”表示，統計方法使用單因素方差分析，P<0.05 則認為差異具備統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清中ANG-1 濃度的變化

如表1 統計結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中ANG-1 濃度明顯降低，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，益母縮宮顆粒高劑量組、縮宮素組大鼠血清中ANG-1 濃度升高，差異顯著（P<0.05）；其余各大鼠血清中ANG-1 濃度無明顯差異，不具備統計學意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清中ANG-1 濃度的變化（）

表1 各組大鼠血清中ANG-1 濃度的變化（）

注：模型組與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；其余組與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 各組大鼠血清中ANG-2 濃度的變化

如表2 統計結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中ANG-2 濃度明顯降低，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，縮宮素組、益母縮宮顆粒高劑量組大鼠血清中ANG-2 濃度升高，差異顯著（P<0.05）；其余各大鼠血清中ANG-2 濃度無明顯差異，不具備統計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠血清中ANG-2 濃度的變化（）

表2 各組大鼠血清中ANG-2 濃度的變化（）

注：模型組與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；其余組與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 各組大鼠血清中VEGF 濃度的變化

如表3 統計結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中VEGF濃度明顯降低，差異極顯著（P<0.01）。與模型組相比，縮宮素組、益母縮宮顆粒高劑量組大鼠血清中VEGF 濃度升高，差異顯著（P<0.05）；其余各大鼠血清中VEGF 濃度無明顯差異，不具備統計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠血清中VEGF 濃度的變化（）

表3 各組大鼠血清中VEGF 濃度的變化（）

注：模型組與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；其余組與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

血管內皮細胞生長因子（VEGF）和血管內皮細胞生長因子受體-2（VEGFR2）所構成的信號通路是作用最強的正性調控血管生成的信號通路之一，對血管新生的整個過程發揮了不可替代的調節作用[7]。血管內皮細胞是產生VEGF 的主要細胞。VEGF 的主要功能受體是VEGFR-2，VEGF 通過與血管內皮細胞膜上VEGFR-2 結合來引發細胞內的信號轉導，進一步對下游的信號網絡通路發揮激活作用，最終促使血管內皮細胞生長、分化、遷移，修復損傷的血管內皮細胞，誘導新生血管生成，維持血管壁的通透性。

血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)及其受體Tie-2，是另一條新的血管生成信號轉導通路，在人類血管形成中發揮著非常重要的作用[8]。Ang(血管生成素)具有調節血管穩定和血管新生的功能，有Ang-1 和Ang-2 兩個亞型，Tie-2 是其共同受體。Ang-l 和Tie-2 結合后促使Tie2 磷酸，Tie2磷酸化的內皮細胞可以吸引血管平滑肌細胞、周細胞等聚集，從而促使內皮細胞形成完整的血管腔壁，促進血管形成。還可以通過細胞與細胞、細胞與基質等相互作用維持血管結構的穩定[8]。Ang-2 與Tie-2 結合能競爭性拮抗Ang-1 促使Tie-2 磷酸化的作用，抑制血管的穩定性，增加內皮細胞對VEGF 的敏感性，從而增加VEGF 血管新生作用[9]。

藥物流產后子宮異常出血屬傳統醫學的“產后惡露不絕”“胞衣殘留”等范圍，中醫證型以“多虛多瘀”為特點，病機以“瘀血阻滯”為中心。舊血不去，新血不生，中醫治療主要以活血化瘀為主。益母縮宮顆粒具有活血化瘀，促進宮縮的作用。前期研究證實益母縮宮顆粒可以促進藥物流產不全大鼠子宮復舊，促進子宮平滑肌收縮，縮短陰道出血時間[10]。本研究顯示，益母縮宮顆粒高劑量組能顯著升高模型大鼠血清中VEGF、Ang-1、Ang-2 的含量，其可能通過此途徑調節VEGF、Ang-1、Ang-2 的表達來促進子宮內膜創面新生血管形成，促進子宮內膜修復，從而減少模型大鼠出血時間及出血量。