河蟹肝胰腺壞死的組織病理和理化指標變化分析

趙 欣，習丙文，2，張鳳翔

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇 無錫 214128；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫 214081；3.興化市現代農業發展服務中心，江蘇 興化 225700)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，是我國重要的特色淡水養殖品種之一。國內河蟹養殖業從20世紀80年代開始快速發展，在一些地區已成為標志性養殖水生動物。隨著養殖的不斷發展，病害成為困擾河蟹健康養殖的重要問題。近年來，江蘇鹽城、興化以及周邊等河蟹養殖區出現大量死亡情況。病蟹外表正常或發黃，肥滿度和活力下降、少食甚至不進食，隨著病情的逐漸加重，肝胰腺由金黃色逐漸變成淺黃，最終為灰白色，胸腔有積液等情況(陸宏達等，2017；宋學宏等，2007)。根據這些臨床癥狀，該類疾病被稱為中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合征(Hepatopancreatic necrosis syndrome，HPNS)。調查發現多種原因均可造成中華絨螯蟹肝胰腺發生病變壞死，并且有研究表明HPNS 可能與微孢子蟲感染有關(趙彥華等，2017)。

本文以河蟹為研究對象，通過對江蘇省不同地區河蟹調查采樣，研究壞死肝胰腺的組織病理變化，檢測了壞死和正常河蟹肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(G-PX)活性及丙二醛(MDA)、糖原含量，同時，進一步探究肝胰腺壞死是否與孢子蟲感染有關。研究結果將對揭示該病的病因和確定有效的預防措施等方面提供一定的理論依據。

一、材料與方法

1.試驗材料

在江蘇省范圍廣泛調查和采集河蟹。中華絨螯蟹于2017 年6－9 月從江蘇省的南通、常州前黃、南京溧水、興化安豐、鹽城大豐5個地區進行樣品采集。采集的肝胰腺樣品首先在0.67%的生理鹽水中沖洗干凈，部分樣品保存于4%福爾馬林中，用于形態觀察；同時保存一部分樣品于液氮中用于分子生物學分析和生化指標測定。

2.試驗方法

(1)河蟹肝胰腺組織病理觀察。首先解剖觀察河蟹肝胰腺是否有變化，將采集的肝胰腺樣品用4%福爾馬林固定，經梯度酒精脫水、石蠟包埋，切片厚度為5微米，蘇木精—伊紅(H.E)染色，顯微鏡下觀察、拍照，對采集自江蘇省不同地區的河蟹肝胰腺分別進行組織病理分析。

(2)河蟹肝胰腺生化指標測定。從液氮中取健康與病變蟹肝胰腺各0.1 克，與預冷的生理鹽水(0.67%氯化鈉溶液)按1∶9(M/V)混合后冰浴勻漿制成10%勻漿液，然后于4℃、4 000 轉/分條件下離心10 分鐘，取上清液。采用南京建成生物公司所研發的試劑盒來測定SOD、CAT、G-PX 的活性和MDA、糖原的含量。

(3)河蟹肝孢蟲檢測。將各個地區的樣品用試劑盒提取總基因組DNA，根據文獻中的特異引物，采用的PCR 檢測方法：上游引物為MF1：5'-CCGGAGAGGGAGCCTGAGA-3'，下游引物為MR1：5'-GACGGGCGGTGTGTACAAA-3'，以被提取的樣本DNA 為模板，以MF1、MR1 為正向和反向引物進行片段擴增。PCR 反應體系為引物MF1(10 毫摩)1 微升、引物MF2(10 毫摩)1 微升、EX 10×Buffer 2 微升、dNTPs(2.5 毫 摩)4 微 升、EX TaqDNA 聚 合 酶(5 單位/微升)0.2 微升、模板DNA 2 微升、去離子水15 微升。反應條件為：95℃變性4 分鐘；接著35 個循環的95℃1 分鐘、58℃30 秒、72℃45 秒；最后是72℃延伸5 分鐘，4℃保存。在PCR 反應結束后，在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，在凝膠成像系統拍照觀察，若樣品在931 bp 處出現條帶，即可判定為陽性。

3.數據統計與分析

采用SPSS 19.0統計軟件，對病變蟹和健康蟹數據進行獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著。健康蟹和病變蟹的所有測定數據的樣本數n＝20，實驗數據均用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

二、結果與分析

1.中華絨螯蟹臨床癥狀

作為對照采集的健康蟹活力高、攝食能力強、甲殼堅硬、附肢肌肉結實、鰓絲正常光澤、肝胰腺飽滿呈金黃色。剛開始發病的蟹外表無明顯的異常、攝食能力逐漸減弱，隨著病情發展，蟹甲殼變軟發黃或發黑、附肢空殼且肌肉萎縮、附肢無力、反應遲鈍、斷裂后便流出大量液體、鰓絲發黑萎縮；打開病蟹的頭胸甲，肝胰腺顏色逐漸變淡、肝胰腺量減少、胸腔中積液量增多，并且肝胰腺壞死現象多發于雄蟹。經觀察發現，肝胰腺顏色隨著病蟹發病程度加重而有規律地變化，肝胰腺由金黃色變為淺黃色，最后萎縮為灰白色，一般少食或停止進食，嚴重消瘦。由于蟹的可食部分肝胰腺糜爛萎縮，肌肉大量減少，使蟹失去食用價值，從而降低經濟價值。

2.河蟹肝胰腺組織病理分析

河蟹肝胰腺由許多分枝肝小管組成，肝小管由基膜和4 種肝胰腺細胞(泡狀細胞、吸收細胞、纖維細胞、胚細胞)構成。細胞核整齊排列，細胞間界線清楚，基膜完整沒有褶皺。中華絨螯蟹在發病初期肝胰腺為淡黃色，基膜微微皺縮，接著肝細胞大部分萎縮、變形。細胞排列紊亂，細胞間界線逐漸消失，部分壞死細胞脫落至肝小管管腔內，基底膜變形，部分破裂解體。肝胰腺細胞與基膜分離，出現空隙，肝小管嚴重破損，整個肝胰腺呈糨糊狀，后期萎縮成灰白色(圖1)。

圖1 肝胰腺組織病理

3.河蟹肝胰腺生化指標分析

正常蟹與病變蟹生化指標見表1。由表1 結果可知，壞死肝胰腺總蛋白質含量極顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.01)；壞死肝胰腺的SOD、CAT、GPX的活力均有不同程度的降低，而MDA的含量表現為一定程度的升高。其中，壞死肝胰腺SOD 和CAT的活力顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.05)，而壞死肝胰腺G-PX 的活力極顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.01)，壞死肝胰腺MDA 的含量極顯著高于正常肝胰腺組(P＜0.01)；壞死肝胰腺糖原含量極顯著低于正常肝胰腺組(P＜0.01)。

表1 正常蟹與病變蟹生化指標比較

4.河蟹肝孢蟲感染情況調查

微孢子蟲調查地區具體采集位置分別為南通、常州前黃、南京溧水、興化安豐及鹽城，在調查江蘇省的5個地區中，共隨機抽取中華絨螯蟹85 只，其中有14 只感染微孢子蟲，陽性率為16.5%，其中常州前黃的樣品感染率最高，其次為南通和興化安豐，具體感染情況見表2。

表2 江蘇地區河蟹肝孢蟲感染情況

三、討論

1.組織病理和理化指標變化分析

肝胰腺是甲殼類動物最重要的消化免疫器官，同時也是中華絨螯蟹最重要的營養物質消化吸收和儲存器官。患病河蟹的肝胰腺病變十分嚴重，大部分細胞萎縮、變形，細胞排列紊亂，細胞間的界限模糊，上皮細胞與基膜分離，出現空隙，這與陸宏達等(2017)描述的中華絨螯蟹水癟子病不同發病階段的病理變化特點相一致。由于這些病變破壞了細胞功能，從而導致肝胰腺物質和能量吸收、儲備和代謝等主要生理功能紊亂，最終影響到整個機體的新陳代謝(成永旭等，2000)。

本研究顯示，壞死肝胰腺中SOD、CAT、G-PX活力降低，由于河蟹患病后代謝過程中產生大量自由基，導致清除自由基酶的損耗，也就出現SOD、CAT、G-PX 酶活力降低的現象；接著脂質過氧化，從而引起MDA 含量升高，繼而損傷肝細胞，最終引起細胞結構和功能的破壞、肝胰腺功能異常。由于肝細胞的損傷，肝胰腺物質合成、消化吸收功能紊亂，會造成患病河蟹食欲下降或者不吃食；而能量代謝功能紊亂，直接影響到能量供應；由于攝食量減少或停止攝食，機體能量不足，肝胰腺中的糖原分解供能，因此，壞死肝胰腺中的糖原含量顯著低于正常肝胰腺。

2.河蟹肝孢蟲感染情況調查分析

本次調查中發現，一些具有典型肝胰腺壞死綜合征的河蟹在進行河蟹肝孢蟲檢測時出現陰性信號，而未有該癥狀的河蟹卻檢測出河蟹肝孢蟲，因此初步認為河蟹肝孢蟲并不是導致河蟹肝胰腺壞死綜合征的病原。同時結果顯示江蘇省河蟹肝孢蟲感染情況偶有發生，但是相比于趙彥華等(2017)報道河蟹肝孢蟲感染率略低。有研究表明養殖水域環境對河蟹肝孢蟲感染有重要影響(Ding Z 等，2016)。調查中發現，感染河蟹肝孢蟲的蟹池養殖環境較差，蟹池中水草生長過密、水體渾濁、水質較差，會引起并加劇河蟹的脅迫反應，從而大大提高河蟹肝孢蟲感染率。

目前，關于水產動物病害的研究存在一病多癥、一癥多病、同名異病和同病異名等問題，并且寄生蟲性疾病、病毒性疾病、細菌性疾病均可造成中華絨螯蟹肝胰腺病變壞死。因此河蟹肝孢蟲能否確定為中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合征的病原，還需要進一步的研究。