一株梅尼小環(huán)藻的分離純化及鑒定

游 宇

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002)

近年來(lái)，菲律賓蛤仔、縊蟶、美洲簾蛤等貝類(lèi)育苗產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，尋找優(yōu)質(zhì)的硅藻種源、開(kāi)展池塘藻類(lèi)的定向規(guī)?；€(wěn)定培育，已成為貝類(lèi)產(chǎn)業(yè)重要的技術(shù)需求。本文從福建省東山近海的養(yǎng)殖海水中分離得到了一株土著硅藻優(yōu)勢(shì)種。通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡以及掃描電子顯微鏡分析觀察，明確了該土著藻種的形態(tài)特征類(lèi)同于梅尼小環(huán)藻，然后基于18S rRNA 基因以及rbcL 基因的基因序列開(kāi)展了分子鑒定，確定為梅尼小環(huán)藻。梅尼小環(huán)藻(Cyclotella meneghiniana)隸屬于硅藻門(mén)、中心藻綱、圓篩藻目、圓篩藻科、小環(huán)藻屬，大部分生活在淡水環(huán)境中，少數(shù)生活在一些咸水湖或者海洋環(huán)境中(李長(zhǎng)玲，2017)。

一、材料與方法

福建省東山縣近海的魚(yú)蝦混養(yǎng)池塘中，初步發(fā)現(xiàn)一株硅藻優(yōu)勢(shì)種，然后基于水滴分離法和微管分離法進(jìn)行分離純化，并采用f/2培養(yǎng)基，按如下條件在光照培養(yǎng)箱中擴(kuò)培保種：光照強(qiáng)度范圍為100～200 微摩/(米2·秒)，光暗周期為晝12∶夜12，培養(yǎng)溫度(22±1)℃，每天定時(shí)搖藻3～5次。

1.光學(xué)顯微鏡觀察

該株硅藻優(yōu)勢(shì)種經(jīng)過(guò)分離純化后進(jìn)行形態(tài)鑒定及分子鑒定，確定其所歸屬的種屬。在光學(xué)顯微鏡10×100倍下觀察并拍照，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定。

2.電鏡觀察

取來(lái)新鮮并處于硅藻對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的水樣50 毫升左右，濃縮水樣呈藻泥狀。制備硅藻殼：進(jìn)行離心濃縮后留1毫升樣品于試管中，加入同等體積(1 毫升)的分析純濃鹽酸，100℃水浴鍋中加熱22 分鐘，直至原生質(zhì)被除掉；用蒸餾水清洗12 次，將樣品洗至中性，再干燥后鍍金。之后用Jeol JSM-6390LV掃描電子顯微鏡觀察。

3.分子鑒定

(1)基因組DNA 提取。用植物DNA 試劑盒進(jìn)行提取。18S rRNA 和rbcL 基因序列的擴(kuò)增用Taq PCR 混合試劑盒進(jìn)行。反應(yīng)體系為25 微升∶12.5 微升Taq Master MIX；上下游引物各1.0 微升(引物保存濃度10 微摩/升)；DNA 模板1.0 微升；最后加9.5微升dH2O定容到25微升。PCR循環(huán)擴(kuò)增在iCycler 中進(jìn)行。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 分鐘，94℃變性30 秒，51.4℃退火30 秒，72℃延伸2 分鐘，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨后用TAKARA 凝膠試劑盒進(jìn)行純化，送至廈門(mén)鉑瑞生物技術(shù)公司測(cè)序。

(2)序列分析。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 在線(xiàn)比對(duì)。用DNAstar 中Editseq 軟件統(tǒng)計(jì)序列的堿基含量，用MEGA 7 軟件分析序列特征、同源性和遺傳距離，并基于Neighbor Joining(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

二、結(jié)果

1.形態(tài)特征

光學(xué)顯微鏡下觀察如圖1。用目鏡測(cè)微尺對(duì)分離到的梅尼小環(huán)藻進(jìn)行初步的直徑測(cè)量，發(fā)現(xiàn)該藻的直徑在5～16微米。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察梅尼小環(huán)藻

在光學(xué)顯微鏡下可觀察到該藻有兩個(gè)面，一個(gè)殼面呈圓形，另一個(gè)殼面為方形。有部分藻細(xì)胞通過(guò)殼面相連聚集在一起，部分連成短鏈狀群體(2～3 個(gè)細(xì)胞)，部分則為單細(xì)胞。細(xì)胞形狀呈現(xiàn)鼓形、短圓的柱狀，多數(shù)具有多個(gè)小盤(pán)狀的色素體，顏色為鮮綠色。該藻光學(xué)顯微鏡下的顏色、大小、形狀都符合梅尼小環(huán)藻的特征。

在電鏡下觀察該梅尼小環(huán)藻亞顯微結(jié)構(gòu)，從梅尼小環(huán)藻樣品的外部觀察，在殼面中央?yún)^(qū)域有凹凸，中心區(qū)域大約占了殼面的1/2，上面還有一些不規(guī)則的顆粒——二氧化硅顆粒。其邊緣區(qū)域包括條紋區(qū)域、非條紋區(qū)域且圍繞著中央?yún)^(qū)，兩者互為間隔分布。每5 微米左右就有5～8 個(gè)條紋，且每個(gè)條紋包含有4行網(wǎng)紋，網(wǎng)紋從中央?yún)^(qū)域邊緣延伸到殼套處。再?gòu)膬?nèi)部殼面觀察，可見(jiàn)殼面中央?yún)^(qū)有1個(gè)中央支持突，支持突由3個(gè)圍孔圍著。在邊緣區(qū)，可以看到有6～13 個(gè)的殼緣支持突，每個(gè)殼緣支持突分別有兩個(gè)圍孔圍繞著，且在殼緣區(qū)域能看見(jiàn)單一的唇形突。

2.分子鑒定

實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增得到該土著硅藻優(yōu)勢(shì)種的18S rRNA 基因序列，大小約1 680 bp。擴(kuò)增得到rbcL基因序列，大小約1 400 bp。用MEGA 的Kimura 雙參數(shù)模型進(jìn)行計(jì)算，分析13 株小環(huán)藻18S rDNA 的同源性及遺傳距離結(jié)果。

小環(huán)藻物種間18S rDNA 之間的遺傳距離閾值范圍介于0.001～0.063。小環(huán)藻物種間rbcL 基因的同源性為90.40%～100%，遺傳距離為0.000～0.100。其中該株硅藻18S rDNA與5株Genebank中梅尼小環(huán)藻的同源性為99.80%，遺傳距離僅為0.002；同樣，該株硅藻rbcL 基因序列與5 株梅尼小環(huán)藻同源性分別為99.50%、99.40%、99.40%、99.50% 和99.40% ， 遺 傳 距 離 分 別 為0.005、0.006、0.006、0.05和0.006，可知它們的同源性高，遺傳差距小，親緣關(guān)系較近。

將18S rRNA 基因序列和rbcL 基因序列分別進(jìn)行Blast 比對(duì)和聚類(lèi)分析，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的5 株梅尼小環(huán)藻的18S rRNA 序列聚為一類(lèi)，包括4 株淡水梅尼小環(huán)藻和1 株海水梅尼小環(huán)藻(來(lái)自中國(guó)湛江)均聚為一類(lèi)。

三、討論

本文通過(guò)水滴分離法和微管分離法從福建省漳州市東山海域的對(duì)蝦養(yǎng)殖池中分離到1株硅藻優(yōu)勢(shì)種，并基于顯微和亞顯微的形態(tài)觀察以及分子鑒定技術(shù)，開(kāi)展了該株硅藻鑒定。本文分離到的硅藻優(yōu)勢(shì)種的花紋與細(xì)胞壁、殼面形態(tài)、殼縫、軸面等形態(tài)特征，符合梅尼小環(huán)藻的形態(tài)特征。

硅藻的生境特征也是分類(lèi)學(xué)上的重要參考，其中鹽度被認(rèn)為是微藻分布的重要屏障，通常同一株微藻較少能同時(shí)高度適應(yīng)海水和淡水。但也有例外，T. gessneri 作為一個(gè)大的藻類(lèi)分支，在海洋、半咸水和淡水都有生存的物種(Alverson，2007)。同樣，小環(huán)藻也是“廣鹽性”物種， 特別是梅尼小環(huán)藻的淡水物種與海水物種同屬一個(gè)物種，這表明它可能代表為數(shù)不多的由海洋棲息地到淡水轉(zhuǎn)變的分類(lèi)群(李長(zhǎng)玲等，2017；Scheggia Q J，2009)。

因此，從分類(lèi)學(xué)上來(lái)說(shuō)，僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)差異和生境特征來(lái)鑒定物種，可能發(fā)生一定的差錯(cuò)，特別是淡水和海水的梅尼小環(huán)藻很有可能會(huì)被錯(cuò)誤地鑒定為不同的物種，于是分子鑒定技術(shù)就發(fā)揮了重要作用，在硅藻物種的分類(lèi)和界定研究上具有重要意義。許多學(xué)者利用18S rRNA 基因鑒定了各類(lèi)硅藻，并且用系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)對(duì)它們間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析鑒定(Sorhannus，2017；Stepanek，2014)。本文采用18S rRNA 和rbcL 基因開(kāi)展的分子鑒定結(jié)果表明，18S rRNA 和rbcL 基因的大多數(shù)序列結(jié)果和相應(yīng)序列的相似度在95%以上，并且該梅尼小環(huán)藻與海水、淡水的梅尼小環(huán)藻都在一個(gè)聚類(lèi)分枝上。

此外，小環(huán)藻是對(duì)蝦養(yǎng)殖中后期池塘常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)種，也是雙殼貝類(lèi)的優(yōu)質(zhì)餌料，其直徑為5～16 微米，特別適合貝類(lèi)幼蟲(chóng)與稚貝攝食。利用池塘的天然微藻進(jìn)行雙殼貝育苗及養(yǎng)殖是近年來(lái)重要的產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向，特別是硅藻定向培養(yǎng)技術(shù)不僅對(duì)于維持對(duì)蝦池塘的生態(tài)穩(wěn)定，而且對(duì)于促進(jìn)雙殼貝類(lèi)的規(guī)?；B(yǎng)殖具有重要意義。

特定海域的硅藻土著種是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇并適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件的類(lèi)型，開(kāi)展土著種特別是優(yōu)勢(shì)土著種的分離純化，可為定向培育提供適應(yīng)海域環(huán)境的優(yōu)質(zhì)硅藻種源。福建省漳州市是重要的蟶苗和菲律賓蛤仔的苗種產(chǎn)地和養(yǎng)殖區(qū)，貝類(lèi)餌料生物的種類(lèi)和質(zhì)量對(duì)于產(chǎn)業(yè)發(fā)展非常重要，已有研究表明，采用硅藻及其他藻類(lèi)的混合投喂方式可有效促進(jìn)稚貝生長(zhǎng)(何進(jìn)金，1984)。本文分離純化了1株屬于福建省漳州市的硅藻優(yōu)勢(shì)種，并鑒定為梅尼小環(huán)藻，也是優(yōu)質(zhì)的貝類(lèi)餌料，對(duì)于促進(jìn)魚(yú)、蝦、貝生態(tài)耦合養(yǎng)殖具有重要意義。