凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌特性研究

周子呂，古紹彬，吳 影，王大紅，張 婧

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023)

0 引言

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種革蘭氏陽性、兼性厭氧、無毒、產(chǎn)乳酸的細(xì)菌[1]。凝結(jié)芽孢桿菌具有耐熱性，適宜生長溫度為35～50 ℃，適宜生長pH值為pH5.5～pH6.5[2]。其內(nèi)生孢子在細(xì)胞的末端位置，缺乏細(xì)胞色素C氧化酶，且不能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，這些特點(diǎn)使其與芽孢桿菌屬中的其他菌株區(qū)分開來[3]。由于凝結(jié)芽孢桿菌兼具乳酸菌益生性優(yōu)點(diǎn)和芽孢桿菌抗逆性特點(diǎn)，因此成為近年來益生菌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。

凝結(jié)芽孢桿菌具有良好的益生性，能夠產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如L-乳酸[7]、Coagulin[8]等抗菌物質(zhì)，以及α-淀粉酶[9]、α-半乳糖苷酶[10]、β-半乳糖苷酶[11]、脂肪酶[12]等消化酶類。文獻(xiàn)[13-14]通過小鼠急性毒性試驗(yàn)和長期口服毒性試驗(yàn)等，證明了凝結(jié)芽孢桿菌GanedenBC30TM和MTCC5260無毒性作用，可以作為安全的人類消費(fèi)品。文獻(xiàn)[15]通過對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30，6080全基因組的研究，發(fā)現(xiàn)其不包含任何有害基因。1989年，凝結(jié)芽孢桿菌被美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)列入“普遍認(rèn)為安全”的桿菌名單中。2002年，凝結(jié)芽孢桿菌獲得了歐盟食品安全局(European food safety authority, EFSA)的安全資格認(rèn)定[16]。2016年，國家衛(wèi)生局將凝結(jié)芽孢桿菌列入《可用于食品的菌種名單》。目前，凝結(jié)芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于臨床、畜牧業(yè)和食品行業(yè)[17-18]。

凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050在37 ℃培養(yǎng)18 h，其無細(xì)胞上清液對(duì)藤黃微球菌ATCC 10420具有抗菌活性，對(duì)pH值和蛋白酶敏感，具有一定的熱穩(wěn)定性[19]。根據(jù)文獻(xiàn)[20]關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌LL1103抑菌特性的研究，發(fā)現(xiàn)其生長情況與pH值都對(duì)抑菌活性產(chǎn)生影響，且對(duì)蛋白酶類物質(zhì)敏感。國內(nèi)外關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌抑菌特性的研究大多處在發(fā)酵混合物水平，而混合物的抑菌效果僅限于一些簡單的理化性質(zhì)，不能具體解釋其抑菌活性成分。正是因?yàn)槟Y(jié)芽孢桿菌的抑菌成分尚不清楚，所以制約了其抗菌物質(zhì)在醫(yī)療、食品等各方面的應(yīng)用。本文從凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌特性和有機(jī)酸成分方面進(jìn)行分析，可為凝結(jié)芽孢桿菌抑菌活性來源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

凝結(jié)芽孢桿菌(BacilluscoagulansCGMCC 9951)，河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物育種與代謝調(diào)控研究室分離保藏。

指示菌：志賀氏菌GIMCC 1.236、禽巴氏桿菌GIMCC 1.267，均購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心；豬霍亂沙門氏菌CVCC 2146、鼠傷寒沙門氏菌CVCC 2228、大腸桿菌CVCC 1527、雞白痢沙門氏菌CVCC 553，均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；溶藻弧菌A1由揚(yáng)州大學(xué)付立霞老師惠贈(zèng)；嗜水氣單胞菌GIMCC 1.551、副溶血性弧菌ATCC 17802、哈維弧菌BB 170、霍亂弧菌A1由上海海洋大學(xué)惠贈(zèng)。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸鎂5 g/L，pH8.0。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸鎂5 g/L，瓊脂20 g/L，pH8.0。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH7.4～pH7.6。

1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、DNA提取試劑盒等試劑，均購自上海生工生物工程股份有限公司；硫酸鎂、甲醇、乙醇、硫酸、二氯甲烷、無水硫酸鈉、醋酸異戊酯、戊二醛(體積分?jǐn)?shù)為50%)等試劑，均購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 儀器與設(shè)備

UV2100型紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS-QP 2010 Plus(島津國際貿(mào)易有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 菌株活化

凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)：將-80 ℃甘油保存的凝結(jié)芽孢桿菌接入30 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃、230 r/min搖床培養(yǎng)16～24 h后，以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量2次傳代，37 ℃、230 r/min搖床培養(yǎng)16～56 h。

指示菌培養(yǎng)：以體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入30 mL培養(yǎng)基，30 ℃、230 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.4.2 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌特性的測(cè)定

(1)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌粗品的制備

凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951在液體培養(yǎng)基中37 ℃、230 r/min搖床培養(yǎng)16～56 h，將發(fā)酵液離心(6 000g，10 min，4 ℃)除去細(xì)胞，收集上清液，用0.22 μm過濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩o細(xì)胞的上清液稱為抑菌粗品。

(2)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌效果的測(cè)定

牛津杯法：將過夜培養(yǎng)好的指示菌用0.85%(體積分?jǐn)?shù))的生理鹽水稀釋成1×107CFU/mL的菌懸液，吸取200 μL菌懸液于固體平板上，涂布棒涂布均勻后放置牛津杯，在杯中加入抑菌粗品200 μL，將培養(yǎng)皿在37 ℃下恒溫培養(yǎng)16～24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。其中，牛津杯外徑0.8 cm，每種指示菌設(shè)置3個(gè)重復(fù)，通過抑菌圈平均直徑表征抑菌活性。

(3)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌活性與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系

(4)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌譜

通過牛津杯法測(cè)定抑菌粗品對(duì)不同指示菌的抑菌活性，確定凝結(jié)芽孢桿菌抑菌范圍[21-22]。

(5)不同pH值對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將抑菌粗品的pH值分別調(diào)節(jié)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，37 ℃靜置處理2 h。通過牛津杯法測(cè)定不同pH值下抑菌粗品的抑菌活性。

(6)不同溫度對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

將抑菌粗品分別在30 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃時(shí)處理20 min后，恢復(fù)至室溫，采用牛津杯法測(cè)定抑菌粗品抑菌能力。

(7)抑菌物質(zhì)對(duì)酶的敏感性

將10 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶分別加入到抑菌粗品中，在37 ℃、pH4.5條件下處理2 h，未經(jīng)酶處理的抑菌粗品和酶制劑作為對(duì)照組，通過牛津杯法測(cè)定抑菌粗品的抑菌活性。

由于氣蝕的嚴(yán)重性往往發(fā)生在金屬表面，也可在閥芯、閥座、閥座后流道處噴涂碳化鎢或堆焊一層硬質(zhì)合金，即表面硬化處理，推薦選用STL合金。

1.4.3 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951發(fā)酵液中有機(jī)酸抑菌特性分析

(1)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析發(fā)酵液中的有機(jī)酸

樣品處理：取5 mL離心后的抑菌粗品添加到帶研磨塞的150 mL錐形瓶中，和50 mL、10%(體積分?jǐn)?shù))的硫酸甲醇溶液混合均勻。密封后，將錐形瓶60 ℃恒溫水浴2 h[23]，然后用濾紙將酯化液體過濾到分液漏斗中，分別用15 mL二氯甲烷將酯化液萃取3次[24]，將3次萃取液合并。萃取液用20 mL飽和NaCl溶液洗滌3次，并用無水硫酸鈉脫水，脫水要徹底，以免影響后續(xù)試驗(yàn)。最后，將無水硫酸鈉過濾，直至萃取液澄清透明。

色譜條件：使用配備DB-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)的島津GC-MS-QP 2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，載氣選擇氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 mL。進(jìn)樣口溫度為220 ℃，初始柱溫為60 ℃；然后以8 ℃/min的速度升溫至190 ℃，到達(dá)190 ℃后維持2 min；最后以2 ℃/min的速度將溫度升至210 ℃，達(dá)到210 ℃后維持5 min。電離模式為電子轟擊，電子能量為70 eV。離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍10～400 amu；發(fā)射電流100 mA，檢測(cè)電壓1.1 kV[25]。

(2)有機(jī)酸最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定

用無菌水分別以12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL和400 mg/mL制備有機(jī)酸(丙酮酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸)溶液。將50 μL細(xì)菌懸浮液(1×108CFU/mL)和50 μL不同質(zhì)量濃度的有機(jī)酸溶液分別添加到含有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中，混合均勻后置于37 ℃、230 r/min的恒溫振蕩搖床上培養(yǎng)24 h。把沒有變渾濁的最小濃度記為該有機(jī)酸的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。將未變渾濁的試管繼續(xù)培養(yǎng)24 h，試管中培養(yǎng)基仍未變渾濁的最低濃度記為該有機(jī)酸的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)[26]。以上所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌特性

2.1.1 抑菌活性與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系

試驗(yàn)選取鼠傷寒沙門氏菌CVCC 2228、雞白痢沙門氏菌CVCC 533、豬霍亂沙門氏菌CVCC 2146、志賀氏菌GIMCC 1.236作為指示菌，研究了凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951在培養(yǎng)過程中抑菌粗品活性的變化。凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌活性與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系見圖1。由圖1可知：發(fā)酵培養(yǎng)16 h之前的無細(xì)胞上清液基本沒有抗菌活性，16 h之后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，抑菌活性增強(qiáng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)48 h的無細(xì)胞上清液具有最大的抑菌活性。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌活性與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系

2.1.2 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌譜

凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌譜見表1。由表1可知：凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)對(duì)6種禽畜致病菌和5種水產(chǎn)致病菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果，對(duì)志賀氏菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑為(18.33±0.58) mm。其中，志賀氏菌、禽巴氏桿菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為常見的禽畜致病菌，溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、副溶血性弧菌、哈維弧菌和霍亂弧菌為常見的水產(chǎn)致病菌。研究結(jié)果表明：凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)對(duì)常見革蘭氏陰性致病菌具有廣譜抑菌效果，但是對(duì)革蘭氏陽性菌抑菌作用較弱。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌譜

2.1.3 不同pH值對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)活性的影響

為了研究抑菌物質(zhì)在不同pH值時(shí)的抗菌活性，本文在廣泛的pH條件下進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，研究結(jié)果表明： 不同的pH環(huán)境對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌抑菌活性產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)pH為2～5時(shí)，抑菌物質(zhì)活性隨著pH的減小而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)pH大于5時(shí)，抑菌物質(zhì)對(duì)致病菌基本喪失抑菌活性。這是因?yàn)槟Y(jié)芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生一定的有機(jī)酸，當(dāng)發(fā)酵液pH變小，小于有機(jī)酸的pKa時(shí)，大量的有機(jī)酸以未解離的分子形式存在于發(fā)酵液中，未解離的有機(jī)酸具有良好的脂溶性，能夠通過細(xì)胞膜，將細(xì)胞膜中脂多糖羧基和磷酸基團(tuán)質(zhì)子化，從而破壞細(xì)胞膜的完整性；未解離的有機(jī)酸通過自由擴(kuò)散進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部時(shí)，由于細(xì)胞內(nèi)部偏堿性環(huán)境，有機(jī)酸便會(huì)解離成酸性陰離子和游離質(zhì)子，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化，影響細(xì)胞酶活性、DNA/RNA和蛋白質(zhì)合成，而微生物細(xì)胞膜是無法透過質(zhì)子的，因此必須通過主動(dòng)運(yùn)輸，消耗大量的腺苷三磷酸將質(zhì)子泵出以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸堿平衡，從而抑制致病菌的正常生長[27-28]。然而當(dāng)發(fā)酵液pH大于有機(jī)酸的pKa時(shí)，有機(jī)酸便會(huì)解離成酸性陰離子和游離質(zhì)子，由于酸性陰離子和游離質(zhì)子不能透過細(xì)胞膜，因此抑菌物質(zhì)抑菌效果變?nèi)跎踔羻适А?/p>

2.1.4 不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)活性的影響

溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)活性的影響見圖2。如圖2所示，經(jīng)過不同溫度的處理后，凝結(jié)芽孢桿菌抑菌粗品在37 ℃時(shí)具有最強(qiáng)的抑菌活性，當(dāng)溫度降低和升高時(shí)，該抑菌粗品都具有良好的抑菌活性。研究結(jié)果表明：溫度對(duì)該抑菌粗品活性的影響較小。

圖2 溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)活性的影響

2.1.5 酶處理對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抑菌物質(zhì)活性的影響

為了分析抑菌物質(zhì)抗菌活性是否來自抗菌肽，本文進(jìn)行了酶處理試驗(yàn)。研究結(jié)果表明：當(dāng)抑菌粗品用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后，其抗菌活性下降了約50%，而抑菌粗品對(duì)胃蛋白酶不敏感。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶可以水解多肽鏈中精氨酸或賴氨酸的羧基末端，因此推測(cè)該抑菌粗品中存在一種含有精氨酸或賴氨酸的多肽或蛋白質(zhì)。同時(shí)，本試驗(yàn)抑菌粗品在酶處理后仍保留有約50%的抑菌活性，說明除抗菌肽外，凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951的胞外代謝產(chǎn)物中還存在其他抗菌物質(zhì)，結(jié)合該物質(zhì)對(duì)pH的敏感性，進(jìn)一步證實(shí)了有機(jī)酸起到了一定的抑菌作用。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951發(fā)酵液中有機(jī)酸抑菌特性研究

2.2.1 GC-MS分析發(fā)酵液中的有機(jī)酸

為了研究源自發(fā)酵液中的有機(jī)酸，將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵上清液甲酯化處理后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，得到抑菌粗品的總離子流，見圖3。通過將其質(zhì)譜碎片對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行分析，可以分析得出發(fā)酵液中包含丙酮酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸。

1.丙酮酸;2.富馬酸;3.琥珀酸;4.蘋果酸;5.檸檬酸。

2.2.2 有機(jī)酸最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的確定

為了進(jìn)一步分析哪種有機(jī)酸對(duì)抗菌活性有更大貢獻(xiàn)，對(duì)無細(xì)胞上清液中有機(jī)酸的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)進(jìn)行了分析，得到不同有機(jī)酸抑菌活性，結(jié)果見表2。

表2 有機(jī)酸的MIC和MBC

由表2可以看出：發(fā)酵液中的富馬酸抑菌活性最高(MIC=0.25 mg/mL，MBC=0.5 mg/mL)，其次是蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸，丙酮酸不具備抑菌活性(結(jié)果未計(jì)入表中)。結(jié)合有機(jī)酸的相對(duì)分子質(zhì)量，不難發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量越小的有機(jī)酸其抑菌活性越強(qiáng)，相對(duì)分子質(zhì)量越大的有機(jī)酸其抑菌活性越弱。分析其原因是有機(jī)酸相對(duì)分子質(zhì)量越小，越容易通過外膜孔蛋白進(jìn)入到周質(zhì)空間，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞外膜的功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏，進(jìn)而達(dá)到抑制甚至殺死細(xì)菌的效果。富馬酸和琥珀酸相對(duì)分子質(zhì)量大小基本一致，然而富馬酸具有更好的抑菌效果，原因是其具有α，β-不飽和羰基特殊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)與抑菌活性具有緊密的聯(lián)系。α，β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)是一個(gè)高效的抗菌活性功能域，富馬酸中含有兩個(gè)等價(jià)的α，β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)，這就造成其抑菌效果顯著[29]。蘋果酸相對(duì)分子質(zhì)量比琥珀酸大，然而其抑菌活性卻更好，可能的原因是蘋果酸在分子結(jié)構(gòu)中存在α-OH，而α-OH可以增強(qiáng)物質(zhì)的理化活性。同時(shí)，α-OH的存在使得蘋果酸更容易通過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，起到抗菌作用。

3 結(jié)論

(1)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951在培養(yǎng)16 h前，抑菌粗品基本沒有抑菌活性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，其抑菌活性逐漸增大，在48 h時(shí)抑菌活性達(dá)到最大，且抑菌物質(zhì)具有廣譜抑菌效果，尤其對(duì)革蘭氏陰性致病菌具有良好的抑菌作用。

(2)抑菌粗品在低pH環(huán)境下具有良好的抑菌活性，且具有良好的熱穩(wěn)定性，在胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的處理下抑菌活性有所下降，但仍保留約50%的抑菌活性，推測(cè)其抑菌活性主要來源于有機(jī)酸和抗菌蛋白類物質(zhì)。

(3)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951發(fā)酵上清液中包含丙酮酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸等短鏈有機(jī)酸，其中富馬酸抑菌效果最好，檸檬酸抑菌效果最弱，結(jié)合有機(jī)酸的相對(duì)分子質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量越小的有機(jī)酸其抑菌活性越強(qiáng)，相對(duì)分子質(zhì)量越大的有機(jī)酸，其抑菌活性越弱。