具降膽固醇功能的海洋源乳酸菌的篩選及發酵條件工藝優化

萬婧倞，羅 曼，吳 鵬，黃仕新，唐 旭，徐長安

(自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005)

膽固醇在人體內具有重要的生理作用，是人體合成荷爾蒙以及組成神經細胞不可缺少的重要物質[1]，在體內可轉化成類固醇激素、VD3及膽汁酸等物質。流行病學和臨床研究表明，血清膽固醇水平和心腦血管疾病的發生呈明顯正相關性，血清膽固醇水平每高出正常水平1 mmol，導致心血管疾病的風險便增加約35%[2]。營養學家推薦食物膽固醇的攝入量為每人每天250～300 mg，攝入過多會使血清中的膽固醇升高，誘發冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病[3-4]。因此研究開發具有降膽固醇效果的藥品、保健品及食品已成為當前的研究熱點。

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是指一群發酵糖類產生大量乳酸的細菌總稱，是公認的安全微生物[5]。近些年的研究表明，定殖于腸道中的有益乳酸菌群具有多種保健作用：維持微生態平衡和腸道機能、降低血清膽固醇、緩解乳糖不耐癥、改善肝功能、增強機體免疫功能及抗腫瘤等[6]。Oh等(2015)通過體外試驗發現，從傳統發酵的小米酒中分離所得乳酸菌有作為益生菌制劑用于發酵工業的潛在用途[7]。李昵等(2012)、蒲博等(2014)、丁苗等(2014)證實了乳酸菌在體內的降解膽固醇功能[8-10]。Zhang等(2016)對降低蛋黃膽固醇的復合乳酸菌劑(嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophilus、嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus、雙歧桿菌Bifidobacterium)進行了工藝優化[11]。付永巖等(2019)優化了3株具降膽固醇能力乳酸菌的發酵培養基條件，為菌體高密度培養提供依據[12]。目前所報道的降膽固醇乳酸菌大多來自陸源，而海洋源乳酸菌則鮮有報道。

本研究對海平面300 m以深海洋哺乳動物柏氏中喙鯨(Mesoplodondensirostris)內臟中的乳酸菌進行了降膽固醇活性篩選，并根據篩選所得菌株的生長特性及培養基條件、發酵條件兩個方面采用正交實驗優化各項技術參數，獲得其對降膽固醇的優化條件，為海洋源功能性益生菌制劑的開發應用提供技術參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品取自2017年10月擱淺于福建省寧德蕉城區(三都澳青山海域)的柏式中喙鯨的腸道內含物。無菌操作取樣后將樣品送至本實驗室-20 ℃冰箱保存備用。

蛋白胨購自生工生物工程(上海)有限公司；眎蛋白胨購自青島海博生物技術有限公司；菊糖購自阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白胨、葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、膽固醇購自國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛購自麥克林試劑公司；可溶性淀粉、吐溫80購自西隴化工股份有限公司；試劑均為國產分析純。

1.2 培養基

MRS培養基(1 L)：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.2 g、吐溫80 1.0 mL、葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。調節pH到6.4左右，121 ℃滅菌20 min。

MRS-CHOL培養基(1 L)：在上述MRS培養基礎上添加膽固醇1.0 g，吐溫80 20 mL，牛膽鹽3.0 g。將1.0 g膽固醇置于20 mL吐溫80中，加熱至沸騰后使其溶解，趁熱緩慢倒入培養基中，呈膠束溶液狀態，此時培養基的顏色呈不透明淡黃色。配制好的培養基在121 ℃滅菌20 min后趁熱將試管晃動或上下顛倒振蕩，以使該膠狀物完全溶解，置于室溫中自然冷卻，放置備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株分離純化及降膽固醇功能的篩選 將樣品混合適量無菌水研磨均勻，吸取1 mL研磨液轉移至裝有含9.0 mL 0.9%滅菌生理鹽水的試管中，振蕩搖勻。從1×10-1到1×10-6進行梯度稀釋并吸取0.15 mL研磨稀釋液涂布于MRS(含碳酸鈣)平板上，置于恒溫培養箱37 ℃厭氧培養36～72 h。根據菌落的顏色、大小、光澤、透明程度等，挑取有透明圈的單菌落于MRS平板上進行多次劃線純化，記錄菌落形態特征。將純化菌株進行革蘭氏染色、油鏡和過氧化氫酶實驗，凡是革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陰性的菌株疑似為乳酸菌。純化后菌株接種于MRS斜面培養基上培養，4 ℃保存備用。

采用鄰苯二甲醛法[13]對待測菌進行降膽固醇能力的篩選。將疑似乳酸菌連續活化2次后，按2%接種量接種到MRS-CHOL液體培養基中，37 ℃厭氧培養24 h后取1 mL發酵菌液，離心(8 000 r/min)10 min后取上清液采用鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量，按公式(1)計算降膽固醇率，實驗重復3次。

(1)

式(1)中：A0、A1分別為未接菌上清液和菌株發酵上清液的膽固醇質量含量(mg/mL)。

1.3.2 菌株HJ-S2的分子鑒定 挑取保存于平板上2～3個菌落混合于API 50CH培養基中，制得渾濁度相當于2 McFarland的菌懸浮液，將此菌懸浮液依次加入API 50CH試劑條的孔中，用甘油覆蓋保持厭氧環境，底盤加10 mL水使其保持濕潤的氣體環境，隨后將試劑條浮于水上，37 ℃培養48 h觀察各糖類發酵情況。結果經API-plus軟件分析發酵糖種類確定其菌屬。

采用試劑盒提取細菌DNA，并利用16S rDNA通用引物(27F，1492R)進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳得到清晰的條帶。菌株PCR產物送至上海生工有限公司測序，并將測序結果與GenBank各標準菌株序列進行BLAST比對，使用MEGA 7.0軟件構建系統發育進化樹，完成乳酸菌的分子鑒定。

1.3.3 菌株生長特性的測定 取保存的菌種，在無菌條件下接種至MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h后按2%的接種量連續活化兩次，得乳酸菌菌懸液。將活化后的菌株HJ-S2按2%接種量接入500 mL MRS液體培養基中，37 ℃搖床培養。測定初始培養基的OD600，前期10 h每間隔1 h測定培養液的OD600和pH值，后期每間隔3 h測定培養液的OD600和pH值，連續測定48 h，繪制菌株HJ-S2的生長曲線及pH值變化。

1.3.4 培養基條件對膽固醇降解率的影響 分別用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨以等量代替MRS-CHOL培養基的蛋白胨，將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含不同氮源的MRS-CHOL培養基中，于37 ℃恒溫搖床培養24 h，按“1.2.1”的方法測定不同種類氮源對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。選出確定的氮源后，進一步考察氮源添加量對降解率的影響。

分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、菊糖代替MRS-CHOL培養基中的葡萄糖，測量方法同上，考察不同碳源及添加量對降解率的影響。

將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含膽固醇含量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL的MRS-CHOL培養基中，37 ℃搖床培養24 h，測定不同膽固醇含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。

將菌株HJ-S2按2%接種量接種于含牛膽鹽含量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的MRS-CHOL培養基中，37 ℃搖床培養24 h，測定不同牛膽鹽含量對HJ-S2膽固醇降解率的影響。

1.3.5 不同發酵條件對膽固醇降解率的影響 以“1.3.4”實驗中所確定的MRS-CHOL培養基的各成分含量，將活化后的菌株HJ-S2按2%接種量接種于MRS-CHOL培養基中，37 ℃恒溫搖床培養54 h，每6 h取培養液，測定不同培養時間對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。

菌株HJ-S2活化后按2%接種量接種于MRS-CHOL培養基中，分別于37 ℃、38 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃恒溫搖床培養24 h，測定不同培養溫度對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。

菌株HJ-S2接種于初始pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10的MRS-CHOL培養基中，37 ℃恒溫搖床培養24 h，測定不同初始pH對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。

菌株HJ-S2按1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種于MRS-CHOL培養基中，37 ℃恒溫搖床培養24 h，測定不同接種量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響。

1.3.6 培養基、發酵條件正交試驗 為了確定最佳的液體培養基配方，依據前期單因素條件對菌株HJ-S2膽固醇降解率影響的實驗結果以及細菌生長所需營養要素的基本原則，以膽固醇降解率為指標，分別設計葡萄糖、蛋白胨、膽固醇、膽鹽含量4因素3水平正交試驗及pH、培養時間和接種量3因素3水平正交試驗。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2013軟件分析數據，每個試驗重復3次；采用統計學軟件SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，當p<0.05時，差異被認為是有意義的，結果表示為平均值±標準差；采用Origin 8.0和Excel 2013進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的分離純化及降膽固醇功能篩選

從喙鯨內臟共分離純化出30個單菌落，生理生化實驗及形態學觀察結果顯示，該30株菌為革蘭氏陽性菌，菌落形態為透明、白色或黃色且邊緣規則，油鏡下觀察菌體形態為球狀或桿狀，過氧化氫酶試驗為陰性，符合乳酸菌屬的特征。將所得乳酸菌進行降膽固醇能力篩選實驗，其中降解率小于10%的有6株菌，10%～20%的有8株菌，>20%～30%的有8株菌，>30%～40%的有5株菌，40%以上的有3株菌(HJ-W33、HJ-W64、HJ-S2)，降解率分別為40.69%、40.78%、48.82%，其中HJ-S2(CGMCC No:17720)的降解率最高為48.82%，具有較高的潛在研究價值(表1)。

表1 各分離菌株的降膽固醇能力Tab. 1 Cholesterol-lowering ability of isolated strains

2.2 具降膽固醇功能乳酸菌的鑒定

對菌株HJ-S2進行API 50CH碳水化合物發酵鑒定，將發酵結果(表2)輸入API數據庫進行比對分析，鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，后續為了使鑒定結果更精準，結合16S rDNA序列分析進行分子水平的鑒定。

菌株HJ-S2的PCR產物大小為1.5 kb左右，符合16S rDNA序列長度。將擴增后的PCR產物測序結果與已知標準菌株序列進行同源性對比，BLAST結果顯示該菌株的序列與登錄號為LC379973.1、CP0237771.1以及MH779888.1等植物乳桿菌的16S rDNA基因組序列相似性均為100%，證實了菌株HJ-S2為植物乳桿菌L.plantarum(GenBank登錄號MK248728)。使用MEGA 7.0軟件構建了其系統發育樹，如圖1所示。

表2 乳酸菌HJ-S2的API 50CH鑒定結果Tab. 2 API 50CH result of lactic acid bacteria HJ-S2

圖1 菌株HJ-S2的系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of strain HJ-S2

2.3 菌株的生長特性

菌株HJ-S2的生長特性如圖2所示。前期0～3 h是生長延滯期，該階段菌株適應培養環境，繁殖緩慢，數量增長較少，OD600由0.25緩慢上升至0.38，pH值從初始培養基的6.10下降至5.63。3～24 h是菌株生長對數期，該階段細菌代謝和繁殖快速增長，生長迅速，細菌數呈對數式生長，OD600由0.38迅速上升至1.65，pH值迅速從5.63下降至3.72左右。24～34 h為菌株生長的穩定期，其間活菌數達到最大值且基本保持不變，菌體代謝和繁殖平衡，代謝產物持續積累，OD600維持在1.65左右，此時酸性代謝產物趨于穩定，體系pH值穩定在3.70左右。34～48 h是菌株的衰亡期，該階段活菌數略有降低，部分菌株衰老死亡，且菌株活性降低并趨于停滯，OD600從1.65降至1.50左右且具持續緩慢降低的趨勢，菌體的凋亡使部分酸性代謝產物減少，pH值略有回升，從3.70回升至3.90左右。由此可見，菌株HJ-S2生長速率較快且產酸能力強，適合發酵法制備功能性微生態制劑。

圖2 菌株HJ-S2的生長特性Fig. 2 Growth characteristics of strain HJ-S2

2.4 不同氮源和碳源對膽固醇降解率的影響

考察不同氮源對膽固醇降解率的影響結果如圖3(a)所示。同一菌株在含不同氮源的MRS-CHOL培養基中膽固醇降解率差異顯著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以蛋白胨為氮源的培養基中膽固醇降解率最高，胰蛋白胨略低，眎蛋白胨較低，大豆蛋白胨最低。此外，蛋白胨價格也相對較低，綜合考慮選擇蛋白胨作為發酵氮源。進一步對考察不同蛋白胨添加量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結果如圖3(b)所示，氮源含量對菌株的膽固醇降解率有一定影響。當蛋白胨含量為10 g/L，降解率最高，達到39.28%；當繼續提高蛋白胨的添加量，降解率有所下降，維持在25.80%左右，由此確定正交試驗水平為蛋白胨含量5、10、15 g/L。

考察不同碳源對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響結果如圖3(a)所示。菌株在含不同碳源的MRS-CHOL培養基中膽固醇降解率差異顯著(p<0.05)。菌株HJ-S2在以葡萄糖為碳源的培養基中膽固醇降解率最高，乳糖、麥芽糖、菊糖次之，而可溶性淀粉作為碳源時降解率最低。葡萄糖作為單糖，微生物能很好地直接吸收利用，因此選擇葡萄糖作為發酵碳源。

進一步考察葡萄糖不同添加量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結果圖3(b)所示。當葡萄糖添加量為20 g/L時，菌株HJ-S2對膽固醇的降解率最高，達到42.13%，當繼續提高葡萄糖的添加量，降解率反而下降維持在29.30%左右。因為碳源含量過高使菌體生長過快，過早衰老發生自溶，從而影響菌體對膽固醇的吸收[14]。由此確定正交試驗中葡萄糖含量為15、20、25 g/L。

2.5 膽固醇、膽鹽含量對膽固醇降解率的影響

不同膽固醇含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(a)所示。菌株HJ-S2對膽固醇的降解率隨膽固醇含量的升高先增大后減少，當膽固醇含量為1.0 g/L時，降解率達到最大值為38.94%，隨著膽固醇含量的增加，降解率略有降低，后續維持在26.13%左右。由此確定正交試驗中膽固醇含量為0.5、1.0、1.5 g/L。

不同膽鹽含量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(b)所示。菌株HJ-S2對膽固醇的降解率隨膽鹽含量升高先增大后減少，膽鹽含量為1.0 g/L時，膽固醇降解率較低為18.62%；當膽鹽含量為2.0 g/L時，降解率達到最大值為43.99%；膽鹽含量達到3.0 g/L時，膽固醇降解率達到了38.62%左右，隨著膽鹽含量的升高，膽固醇降解率也相應減小后續維持在37.51%左右。由此確定正交試驗中膽鹽含量為1.5、2.0、2.5 g/L。

2.6 發酵時間、培養溫度對膽固醇降解率的影響

發酵時間對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(c)所示，結合菌株生長曲線進行分析，0～3 h為菌株的生長延滯期，菌體適應培養環境，繁殖緩慢，數量增長較少，此階段膽固醇降解率較低；3～24 h為菌株的對數生長期，此階段細菌數量呈指數增長，細菌代謝繁殖快速增長，培養基中膽固醇含量急劇下降，當培養到24 h時，膽固醇降解率達到最大42.18%；24～34 h為乳酸菌生長的穩定期，膽固醇降低率不再增加且略有下降；34～54 h為菌株的衰亡期，部分菌體衰老死亡，膽固醇降低率逐漸穩定在32.15%左右。

不同培養溫度對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響，結果如圖4(d)所示。不同培養溫度對菌株的降膽固醇能力有一定影響，當培養溫度為34 ℃時，膽固醇降解率最低為25.82%左右；當溫度為37 ℃時，菌株HJ-S2對膽固醇降解率最高達41.39%且與38 ℃時的降解率相差不大；溫度達到40 ℃以上時，使菌體活性相應降低，影響菌體對膽固醇的吸收從而使膽固醇降解率稍有降低。因此后續實驗一直在37 ℃進行分離培養，且菌體的最適溫度為37 ℃，溫度過低或過高都會影響菌體的生物活性。

圖3 氮源和碳源對膽固醇降解率的影響Fig. 3 Effects of nitrogen and carbon sources on cholesterol degradation rate(a)為不同碳源和氮源對降解率的影響；其中1～10分別表示蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、眎蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、菊糖、可溶性淀粉，(b)為蛋白胨、葡萄糖含量對降解率的影響。

圖4 各單因素對膽固醇降解率的影響Fig. 4 Effects of single factor on cholesterol degradation rate(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)分別為膽固醇含量、膽鹽含量、培養時間、pH值、接種量對降解率的影響。

2.7 初始pH值、接種量對膽固醇降解率的影響

不同pH值對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(e)所示。培養基的初始pH值對菌株HJ-S2的膽固醇降解率有很大影響。在pH值低于5時，膽固醇降解率較低，因為菌株在低pH值條件下，活性較低，從而影響菌株的降膽固醇效果。但菌株HJ-S2在初始培養基pH值為2的條件下仍具有降解膽固醇作用，降解率為5.41%，說明菌株對酸環境有很好的的耐受性。隨著pH值的升高，降解率不斷升高，在pH值為6時達到最高點，此環境下的乳酸菌活性較高，降解率達到最大值為42.24%，當pH值高于6時，膽固醇降解率逐步減少。由此確定正交試驗中pH值為5、6、7。

不同接種量對菌株HJ-S2膽固醇降解率的影響如圖4(f)所示。結果顯示接種量大小對膽固醇降解率有較大影響。接種量為1%時，膽固醇降解率較低(18.21%)；隨著接種量的增加，膽固醇降解率也隨之逐漸增加；接種量為2%時，膽固醇降解率達到最大值(35.21%)；當接種量達到3%以上，膽固醇降解率略有降低且基本不變維持在32.10%左右。由此確定正交試驗中接種量為1%、2%、3%。

2.8 培養基、發酵條件正交試驗

根據前期各單因素條件實驗結果，按表3設計培養基及發酵條件正交試驗，試驗結果如表4、表5所示。培養基條件各因素中影響程度的大小關系是C>D>B>A，即對膽固醇降解率影響最大的是底物膽固醇含量，其余依次為膽鹽含量、葡萄糖含量、蛋白胨含量。正交優化結果顯示，A1B3C2D2條件下菌株對膽固醇的降解作用最強，為最佳培養基條件配方。按A1B3C2D2培養基條件進行重復試驗，膽固醇降解率為56.95%，即降膽固醇最優的培養基條件為：蛋白胨5 g/L、葡萄糖25 g/L、膽固醇1.0 g/L、膽鹽2.0 g/L。

發酵條件中各因素對膽固醇降解率的影響程度為A>C>B，即影響最大的因素是培養基pH值，依次是接種量、培養時間。正交優化結果顯示，A2B2C1條件下菌株對膽固醇降解作用最強，為最佳發酵條件配方。按A2B2C1培養條件進行重復試驗，膽固醇降解率為69.81%，即最優培養條件為：pH值6，培養時間24 h，接種量1%。

表3 培養基及發酵條件正交試驗表Tab. 3 Orthogonal experiment table of medium and fermentation conditions

表4 培養基條件正交試驗結果Tab. 4 Orthogonal test results of the medium conditions

表5 發酵條件正交試驗結果Tab. 5 Orthogonal test results of the fermentation conditions

2.9 討論

乳酸菌是發酵食品工業重要的微生物菌種，在自然界中存在廣泛多樣性，水、土壤、植物及動物和人體內均有分布。乳酸菌生理功能十分廣泛，不僅能改善食品風味和營養價值、提高食品的保藏性和附加值，而且具有維持機體微生物菌群平衡和腸道健康、降低血清膽固醇、緩解乳糖不耐癥、增強機體免疫力等多種醫療保健功能。早在1963年，Shaper等發現非洲Samburu部落的人們大量飲用由野生乳桿菌發酵的乳制品后，體內膽固醇含量普遍降低[15]。近幾年的國內外研究發現多種乳酸菌，如植物乳桿菌[16]、嗜酸乳桿菌[17]、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)[18]等均具有降膽固醇特性。Pereira等(2002)研究證實了嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)和嗜酸乳桿菌在體外對膽固醇的吸收作用[19]。肖琳琳等(2003)構建高脂小鼠模型后用從西藏傳統發酵乳中分離的乳酸菌進行實驗，結果顯示實驗組小鼠血清中TC、TG含量較對照組顯著降低[20]。

本研究從生活在海平面以深300 m的喙鯨內臟中篩選出一株具降膽固醇功能的乳酸菌，鑒定為植物乳桿菌并編號為HJ-S2 (CGMCC No：17720)。該菌對膽固醇的體外降解率均優于范穎等(2018)、郭晶晶等(2019)及Shehata等(2016)分離純化的乳酸菌[21-23]，具有較高的潛在開發價值。生長特性實驗顯示菌株的延滯期為0～3 h，對數期為3～24 h，穩定期為24～34 h，衰亡期為34～48 h。從培養基條件(氮源的種類和含量、碳源的種類和含量、膽固醇含量、膽鹽含量)和發酵條件(溫度、pH值、培養時間、接種量)兩方面，采用單因素和正交試驗進行發酵工藝優化。

氮源和碳源含量過高均會使菌體生長過盛，過早衰老發生自溶，從而影響菌體對膽固醇的吸收。本研究經比較選用蛋白胨作氮源，葡萄糖作碳源，能最大程度發揮菌株的降膽固醇作用。膽固醇作為底物，在較高含量時，菌體對膽固醇的吸收達到飽和，且高含量膽固醇對菌體存在一定的抑制作用，從而菌體釋放出已沉淀的膽固醇使降解率減少。劉麗莉等(2004)研究在不同膽固醇含量條件下乳酸菌的降解效果，發現降解率先上升后下降，在1 mg/mL時降解率達到最高[24]，與本研究結果一致。適當的膽鹽含量能提高菌體的通透性，更好地吸收培養基中的膽固醇，菌體吸收后的膽固醇參與菌體自身代謝，合成膽固醇氧化酶，最終使環境中的膽固醇含量降低。Grill等(2010)研究了食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)和雙歧桿菌在膽鹽中的降膽固醇效果，發現菌株的膽固醇降解能力與膽鹽的含量和種類之間有顯著關系[25]。張紅星等(2011)研究發現菌體在一定的膽鹽含量下，其膽固醇降低率較不添加膽鹽的高[26]。本研究中同樣發現在膽鹽含量為2 g/L時降解率達到最高。菌株對膽固醇的降解率與菌株生長量有著密切關系，相關研究表明，菌體生長后期環境中積累大量酸性物質，影響菌體的活性從而降低了菌體對膽固醇的吸收[27-28]。Zhang等(2016)、任大勇等(2014)研究發現菌株發酵23 h左右時，對膽固醇的降低效果達到最大值[11,29]，與本研究發酵時間對膽固醇降解率影響的結果基本一致。菌體的最適溫度為37 ℃，溫度過高或過低都會影響菌體的生物活性，本研究后續一直于37 ℃進行分離培養。當發酵培養基中初始pH值較低或較高時，均不利于菌株的生長，使其膽固醇降解率下降。Noohi(2016)、Kim等(2016)研究了多種乳桿菌在不同pH值條件下的降膽固醇能力，發現pH值條件不同時，膽固醇脫除能力差異顯著[30]。在pH 6.5以下，對膽固醇的脫除量可達60 μg/mL，且乳酸菌在pH 6.5的條件下生長良好，本研究測得的菌株降解率最優pH值為6。適當的活菌數能使膽固醇降低率達到最大值，最大程度發揮菌株的降膽固醇作用。姜華(2010)在降膽固醇乳酸菌的篩選研究中同樣也得出在接種量為3%左右時降解率達到最大值，乳酸菌在生長過程中分泌乳酸，使環境中pH值降低，但低pH值環境不利于菌株的生長從而使膽固醇降解率降低[31]。本研究中接種量為2%時降解率達到最大值。

最后，綜合最優條件設計正交試驗獲得了菌株優化發酵條件，為功能性益生菌劑的開發應用提供參考依據。

3 結論

本研究從喙鯨內臟中篩選出一株具高效降解膽固醇功能的乳酸菌HJ-S2，經鑒定為植物乳桿菌，并命名為HJ-S2。為提高植物乳桿菌HJ-S2的體外降膽固醇能力，考察了菌株的生長特性，并從培養基條件和發酵條件兩個方面，設計了正交試驗方案。通過單因素試驗初步確定了影響菌株膽固醇降解率的各因素水平。在此基礎上，利用正交試驗法對影響植物乳桿菌HJ-S2降解膽固醇效果的發酵培養基及培養條件進行了優化，確定了培養基優化條件為蛋白胨5 g/L、葡萄糖25 g/L、膽固醇1.0 g/L，膽鹽2.0 g/L；發酵優化條件為：培養溫度37 ℃，pH值6、培養時間24 h、接種量1%，在此優化條件下降解率達到69.81%。