耐鹽蘆葦大片段BIBAC載體構建及水稻遺傳轉化

高鴻　馬啟林　吳孚桂　劉慧芳　聶佳俊

摘 ?要：利用鹽生植物的耐鹽基因改良作物耐鹽性是保障土壤鹽漬化地區糧食生產和改良鹽漬化土地的最經濟最有效的途徑。本研究以生長于西北鹽蓋上的一種耐鹽野生蘆葦為材料，制備了Mb級耐鹽蘆葦基因組DNA，酶切后經脈沖場凝膠電泳將其分離為不同大小的大片段DNA區段，并與酶切回收的BIBAC-S載體進行連接，成功構建了耐鹽蘆葦不同大小的大片段DNA-BIBAC載體，經根癌農桿菌EHA105介導，成功地轉化了粳稻品種‘中花11成熟胚愈傷組織，獲得了轉基因水稻植株。研究表明，不同大小的大片段DNA-BIBAC載體在轉化同一受體材料時，其所獲得的愈傷轉化率、植株轉化率、轉基因植株的陽性率等存在差異，說明插入片段的大小與轉化效率之間存在關系。本研究為創制耐鹽水稻新種質、克隆鹽生植物的耐鹽基因提供了理論和技術參考。

關鍵詞：水稻;蘆葦;耐鹽性;BIBAC;大片段DNA轉化

中圖分類號：S511 ? ? ?文獻標識碼：A

Construction of Large Fragment DNA-BIBAC Vector of Salt Tolerant Reed and Its Genetic Transformation in Rice

GAO Hong， MA Qilin*， WU Fugui， LIU Huifang， NIE Jiajun

College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Using the salt-tolerant genes of halophytes to improve crop salt tolerance will be the most economical and effective way to ensure food production in soil salinized areas and to improve salinized land. In this study， a salt-tolerant wild Phragmites australis grown in the saline-alkali soil of Northwestern China was used as the materials to prepare Mb class genomic DNA， which was digested by restriction enzyme， and was separated into different size of DNA segments by pulsed field gel electrophoresis， then connected with the BIBAC-S vector， and successfully constructed the salt tolerant reed large fragment DNA-BIBAC vector. The large fragment DNA-BIBAC vector was successfully transformed into the callus of the mature embryo of ‘Zhonghua 11 mediated by Agrobacterium tumefaciens EHA105， and 23 transgenic positive rice plants were obtained. The results showed that there were differences in callus transformation rate， plant transformation rate and transgenic plant positive rate among different sizes of the DNA-BIBAC vector， indicating that there was a relationship between the size of inserted fragments and transformation efficiency. This study would provide a theoretical and technical reference for creating new germplasm of salt tolerant rice and cloning salt tolerant genes of halophytes.

Keywords： Oryza sativa L.; Phragmites australis; salt tolerance; BIBAC; genetic transformation of large DNA fragments

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.006

隨著全球氣候變化和土地的不合理使用，世界上大約三分之一的耕地都不同程度地受到自然或次生鹽漬化的影響[1-2]，越來越嚴重的土壤鹽漬化現象導致可耕地面積下降。土壤鹽漬化是嚴重制約世界各地植物生長、造成作物減產的主要非生物脅迫因子之一[3-7]，阻礙著農業生產的可持續發展，威脅著全球糧食安全[8-9]。為了維持作物正常生長、保障糧食安全，加強鹽堿地資源的開發利用，改良和培育耐鹽作物新品種已成為重要的課題和研究的熱點。其中，選育和種植具有較高耐鹽性的作物新品種，已經成為保障土壤鹽漬化地區糧食生產和改良鹽漬化土地的有效途徑之一[10-11]。

水稻（Oryza sativa L.）是甜土植物，對鹽脅迫敏感。從現有水稻種質資源中篩選耐鹽材料以及通過常規育種手段改良現有水稻品種的耐鹽性，雖取得了一定的進展，但這些品種所表現出的耐鹽能力不強，滿足不了鹽堿地生產的要求。隨著現代分子生物技術的快速發展，利用發現和克隆到的鹽生植物的耐鹽基因，培育耐鹽水稻新品種是提高水稻耐鹽性，維持鹽堿地農業生產的重要途徑之一[12-13]。盡管利用生物工程技術將特定外源基因導入水稻后，一定程度上提升了水稻的耐鹽能力[14-16]，但因為耐鹽性是受多數數量性狀基因控制的復雜性狀，轉移單個基因對提高水稻耐鹽性的作用比較有限，仍然難以達到鹽堿地水稻生產的要求。因此，同時轉化多個耐鹽基因及其調控因子，是大幅提高作物耐鹽性的必要途徑。

雙元細菌人工染色體（bibary bacterial artificial chromosome，BIBAC）載體可以在大腸桿菌和根癌農桿菌中復制，與一般載體相比，除了能構建大片段文庫外，還能直接用于大片段DNA、多基因或基因簇的遺傳轉化，來促進基因發現和功能研究[17-18]。利用BIBAC載體已成功構建了番茄[19]、野生稻[20]、粳稻[21]、鹽芥[22]等基因文庫，為后續優良基因的發掘與利用奠定了基礎。同時，利用BIBAC載體將大片段成功轉入植株基因組中，如Hamilton等[23]和Frary等[24]利用BIBAC載體將150 kb外源片段通過農桿菌介導法轉入煙草和番茄基因組中，He等[20]將攜帶褐飛虱抗性基因的120 kb片段-BIBAC載體成功導入水稻基因組中。

一種生長于西北鹽蓋上的野生蘆葦，具有極強的耐鹽性，與水稻同屬禾本科，對提高水稻的耐鹽性具有極高的潛在價值。本研究以此耐鹽野生蘆葦為材料，構建了耐鹽蘆葦大片段DNA- BIBAC載體，利用農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織，并成功獲得了轉基因植株。耐鹽蘆葦大片段DNA轉化水稻技術為創制耐鹽水稻新種質，以及后續克隆耐鹽蘆葦的耐鹽基因奠定了基礎，同時對于水稻耐鹽性的提高、鹽堿地的有效利用等具有潛在的重要價值。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供體材料為一種生長于西北鹽蓋上的野生蘆葦。pHZAUBIBAC1載體由華中農業大學羅美中教授惠贈;大腸桿菌菌株DH10B，購自上海唯地生物科技有限公司;根癌農桿菌EHA105，購自北京華越洋生物科技有限公司;CIP（小牛腸堿性磷酸酶）、T4 DNA連接酶、Lambda PFG ladder購自NEB公司;BamH I、λDNA、I-Sce I購自Thermo Scientific公司;質粒提取試劑盒購自OMEGA公司;用于轉化的材料粳稻‘中花11（Oryza satva L. subsp. japonica cv Zhonghua11）以及209轉基因‘中花11質粒由海南波蓮水稻基因有限公司提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?BIBAC-S載體質粒的制備 ?取?80 ℃凍存的pHZAUBIBAC1菌株于LB固體平板上進行劃線培養，再挑選單菌落于含有12.5 ?g/mL Amp和Kan的LB液體培養基中振蕩培養，待菌液處于對數生長期，利用OMEGA試劑盒進行載體質粒提取，微量分光光度計及凝膠電泳檢測提取的質粒質量;將提取的載體質粒置于37 ℃下酶切2.5 h;酶切完成后，37 ℃下脫磷50 min，隨后進行純化及自連反應;將上述已完成自連的載體DNA進行1%脈沖場凝膠電泳分析，通過凝膠成像平行切割出含有目的載體BIBAC-S的凝膠塊，裝入無菌并含有100 μL 0.5×TBE透析袋中（8000～ 14000 D）進行電洗脫回收，檢測回收液的質量。脈沖場凝膠電泳條件：泵速70，6 v/cm，1～50 s，120°，0.5×TBE，14 ℃，14 h;電洗脫回收條件：4 ℃，125 V，2.5 h，電泳結束后180°顛倒透析袋，繼續電泳2 min。

1.2.2 ?蘆葦大片段DNA的制備 ?參照文獻[25]來制備蘆葦大片段DNA，并從脈沖場凝膠電泳后的凝膠中切割出含有50～300 kb大小的蘆葦DNA片段的凝膠塊，電洗脫回收凝膠中的DNA大片段，電洗脫條件同1.2.1。檢測回收DNA的濃度，確定目的DNA濃度大于1 ng/μL才能進行后續連接實驗。

1.2.3 ?蘆葦大片段DNA-BIBAC載體構建 ?將回收的BIBAC-S載體和不同大小的蘆葦大片段DNA通過T4連接酶16 ℃連接16 h;將連接產物吸入至脫鹽膠，靜置于冰中1.5 h，進行脫鹽處理;脫鹽處理后的連接產物通過電擊轉化至大腸桿菌DH10B中;涂板培養，挑選陽性克隆搖菌，利用堿裂解法提取克隆質粒;利用I-Sce I對BIBAC克隆質粒進行酶切，脈沖場凝膠電泳檢測，獲取插入不同大小的蘆葦大片段DNA陽性克隆。脈沖場電泳條件：泵速70，6 v/cm，5～15 s，120°，0.5× TBE，14 ℃，16 h。

1.2.4 ?BIBAC載體遺傳轉化水稻愈傷組織 ?粳稻‘中花11種子去殼，用25%的NaClO消毒15～20 min，無菌水清洗7～8次后平鋪于無菌濾紙上風干30 min，接種到誘導培養基，33～34 ℃恒溫暗培養35～40 d，將種子胚周圍新生長出的愈傷組織進行繼代培養;從繼代培養基中挑選出顏色嫩黃、表面干燥、生長旺盛的愈傷組織轉移至預/共培養基（含100 μmol/L乙酰丁香酮）上，25 ℃暗培養4 d;用含有不同片段BIBAC載體的EHA105菌液（OD600值為0.4～0.6，含100 μmol/L乙酰丁香酮）侵染25 min，置于無菌濾紙風干，轉移至預/共培養基中25 ℃暗培養3 d;用滅菌超純水將共培養愈傷組織上的農桿菌沖洗干凈，再加入500 mg/L的頭孢水浸泡25～30 min，風干愈傷后，轉移至篩選培養基（含50 mg/L的Hyg和500 mg/L的頭孢）中，28 ℃暗培養20～50 d，期間更換一次培養基;將抗性愈傷組織轉入分化培養基（含2 mg/L KT和2 mg/L NAA）中，置于25 ℃光照培養20～50 d;將分化出小苗的根清理干凈后，轉移至1/2 MS生根培養基中，25 ℃光照培養15 d;解開封口膜，加入2～3 cm的自來水后培養2～3 d進行煉苗，移苗完成后移栽至水稻池中。誘導與繼代培養基成分：100 mL/L 10×N6大量、10 mL/L 100×N6微量+100× N6有機+100× N6鐵鹽、2，4-D（1 mg/mL）、0.5 g/L脯氨酸、0.6 g/L水解絡蛋白、30 g/L蔗糖、3 g/L植物凝膠，pH 5.9，116 ℃滅菌15 min，其中2，4-D（1 mg/mL）在誘導培養基與繼代培養基中的加入量分別為3 mL/L和2.4 mL/L。

1.2.5 ?PCR篩選遺傳轉化植株 ?CTAB法提取轉化植株的DNA，用潮霉素和水稻內參基因Actin引物進行PCR擴增鑒定轉基因植株。引物序列見表1。PCR反應體系均為：0.4 μL模板DNA、5 μL 2×Taq MasterMix（Dye）、0.25 μL 10 μmol/L Hn-F/R引物、（或0.4 μL 10 μmol/L LH-F/R引物），用滅菌雙蒸水補足10 μL。PCR反應條件均為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，共進行30個循環;72 ℃延伸5 min。PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定轉基因陽性植株。2對引物的擴增長度分別為664 bp和110 bp。

1.3 ?數據分析

記錄農桿菌介導不同片段大小的BIBAC載體在轉化水稻過程中抗性愈傷數目、再生植株數目以及陽性植株數目，并計算出各自最終的遺傳轉化效率。愈傷轉化率=抗性愈傷數目/侵染的總愈傷數目×100%;植株轉化率=再生植株數目/接種的抗性愈傷總數目×100%;植株陽性率=陽性植株數目/檢測植株總數目×100%;終轉化效率=愈傷轉化率（%）×植株轉化率（%）×植株陽性率（%）× 100%。

2 ?結果與分析

2.1 ?BIBAC-S載體質粒與蘆葦大片段DNA的制備

經搖菌培養后提取的pHZAUBIBAC1載體質粒濃度約為400 ng/μL左右，并且DNA條帶清晰，純度較高。不同時間的酶切效果顯示，當酶切至2.5 h時，載體質粒酶切完全，其濃度約為25 ng/μL左右（圖1A）。依據此條件，對pHZAUBIBAC1載體質粒酶切2.5 h，經脫磷純化后進行脈沖場電泳分離，從圖1B中可知BIBAC-S載體條帶亮度明顯，說明載體濃度較高，并且BIBAC-S與PGEM-4Z載體已經完全分離;圖1B中黑色部分的凝膠在顯色前被平行切割出來，用于電洗脫回收BIBAC-S載體，該部分凝膠中含有與“V”列相同的BIBAC-S載體質粒。電洗脫回收的BIBAC-S載體經電泳檢測，回收的BIBAC-S載體質粒純度高，濃度約為20 ng/μL，符合載體連接時的要求（圖1C）。同時，對提取的Mb級耐鹽蘆葦基因組DNA經酶切、脈沖場電泳分離、凝膠切割、電洗脫回收，回收的載體濃度在2～4 ng/μL左右，滿足與載體連接時的要求（圖1D）。

2.2 ?蘆葦大片段DNA-BIBAC載體的構建

在電洗脫回收的載體DNA與目的大片段DNA連接轉化后的篩選平板中，隨機挑選12個白斑單菌落搖菌，提取質粒，I-Sce I單酶切，酶切產物經脈沖場凝膠電泳檢測。從圖2可知，12個單克隆均為陽性克隆，均含有插入片段且不存在空載現象，插入片段大小介于50～150 kb之間，不存在雙克隆和多克隆的現象，總體來說蘆葦大片段DNA-BIBAC載體構建非常成功。隨后，將構建好的載體轉化農桿菌EHA105，用于水稻的遺傳轉化。

2.3 ?蘆葦大片段DNA-BIBAC載體遺傳轉化水稻

水稻愈傷組織的誘導與繼代：水稻種子接種到愈傷組織誘導培養基上，33～34 ℃條件下暗培養40 d長出愈傷組織（圖3A）;愈傷組織繼代培養（圖3B）。抗性愈傷組織的篩選：農桿菌與愈傷組織在25 ℃條件下暗培養4 d后，轉移至篩選培養基，一部分愈傷組織會褐化死亡，一部分會長出新的米黃色抗性愈傷組織（圖3C）。抗性愈傷組織的分化：轉移抗性愈傷組織于分化培養基中分化，愈傷會慢慢分化變大，并逐漸轉綠，最后分化出幼苗（圖3D）。抗性轉化苗的生根與移栽：將分化出的幼苗根部清理干凈，轉移至生根培養基上進行生根培養（圖3E）;待幼苗復壯后煉苗3 d，移栽至室外水稻池中（圖3F）。

2.4 ?遺傳轉化苗的PCR鑒定

提取轉基因苗葉片DNA，用潮霉素（Hn664）基因和水稻內參（Actin110）基因引物進行PCR擴增，部分擴增結果如圖4所示。由圖4可知，已轉化成功的水稻植株能擴增出與陽性對照相同大小的條帶，證明農桿菌介導的BIBAC載體已經成轉入粳稻‘中花11中。

2.5 ?大片段DNA-BIBAC載體轉化效率

本試驗轉化了3組不同大小的大片段DNA- BIBAC載體，其大小分別為50～75 kb、60～90 kb和90～120 kb，遺傳轉化結果如表2所示。由表2可知，獲得陽性植株總數為23株，3組不同大小的大片段DNA-BIBAC載體的最終轉化效率分別為7.71%、7.23%和2.99%，初步的轉化數據顯示，插入DNA片段越大轉化效率越低。

3 ?討論

利用大片段DNA轉化技術或原位的基因組導入技術向栽培作物中導入有益性狀進行遺傳轉化是作物改良中的有益實踐。許多研究已經證實外源基因的大片段DNA能穩定地導入植物基因組。通過對許多禾本科植物基因組的比較，已經發現含有功能基因的大片段DNA在遠緣物種間是可以橫向傳遞的，并且被受體物種接受使用，擴展了遺傳基礎，這可能是植物進化的重要驅動力[26]。

盡管存在爭議，但農桿菌介導的轉化系統由于其T-DNA的精確處理和低拷貝數轉基因的簡單整合，已成為生產轉基因水稻品種的較好選擇。大片段DNA轉化過程中的許多因素決定了轉化效率或者直接導致試驗失敗。外植體鑒定、基因轉移技術、整合構建、無遺傳損傷的轉基因表達和轉化子選擇是影響水稻轉化的技術難題，獲取大片段DNA轉化過程中的這些信息對于改良難馴化水稻品種的轉化體系是必要的[27]。本研究結果顯示，pHZAUBIBAC1的酶切對于后續實驗極為重要，若酶切不完全，那么pHZAUBIBAC1載體會夾雜其中，降低線性BIBAC-S載體回收的純度，從而影響到后續BIBAC-S載體與大片段DNA的連接效率，在進行DH10B轉化時，空載體會優先于重組質粒進入大腸桿菌，產生大量藍斑，影響篩選。酶切之后的脫磷也對后續實驗起著關鍵性作用，脫磷時間過長會降低連接效率，脫磷時間過短會讓載體產生自連，2種情況都會產生數目較多的藍斑，經多次摸索試驗，脫磷的最適時間在55～65 min之內。脫磷后利用電洗脫的方法來進行載體與蘆葦大片段的回收，與試劑盒回收比較起來，此方法回收的濃度會比試劑盒回收的載體濃度低，但是其回收純度高，能夠最小限度地對目的載體和大片段造成機械損傷，保證其完整性，可有效提高連接效率。

利用農桿菌EHA105介導粳稻中花11的轉化過程中，選擇生長旺盛的愈傷組織作為轉基因的受體能夠提高轉化效率[28];同時選擇合適的菌液濃度與侵染時間也至關重要[29]。有研究認為，在BIBAC系統中，高濃度的農桿菌細胞可提高轉化效率，若農桿菌濃度過低且侵染時間過短會出現侵染不充分，導致轉化效率變低且篩選時大量愈傷發生褐變死亡的情況[30]。本研究中，侵染粳稻‘中花11的菌液濃度OD600為0.4～0.6之間，侵染時間為25 min。若農桿菌濃度過高且侵染時間過長會導致大量農桿菌增殖，對植物細胞造成傷害且脫菌困難，降低愈傷組織的再生頻率且容易導致后續實驗出現農桿菌污染的情況。此外，有研究表明水稻中可能缺少對農桿菌Vir基因活化所需的酚類物質，因此表現出對農桿菌并不敏感，所以在懸浮液和預/共培養基中加入少量的乙酰丁香酮（AS）能夠有效提升轉化效率[31]，是轉化的必要條件。

本研究通過農桿菌介導法，將耐鹽蘆葦不同大片段DNA-BIBAC載體對粳稻‘中花11進行遺傳轉化，經過PCR擴增初步鑒定獲得陽性植株23株，實現了農桿菌介導的大片段DNA在水稻中的遺傳轉化，為創制耐鹽水稻新種質，以及后續挖掘和克隆蘆葦耐鹽相關基因奠定了基礎。但從最終的轉化效率來看，不同大小的大片段DNA載體在轉化同一受體材料時，因其所獲得的愈傷轉化率、植株轉化率、轉基因植株的陽性率等存在差異，說明插入DNA片段的大小與轉化效率之間有一定關系。今后在創制耐鹽水稻新種質的時候，既要考慮一次轉入片段的大小，在導入更多基因的同時，也要考慮遺傳轉化的效率，從而獲得更多的突變體。

參考文獻

[1] Li B， Takahashi D， Kawamura Y， et al. Comparison of plasma membrane proteomic changes of Arabidopsis suspension-cultured cells （T87 line） after cold and ABA treatment in association with freezing tolerance development[J]. Plant Cell Physiology， 2012， 53（3）： 543-554.

[2] Wang X， Wang J G， Liu H L， et al. Influence of natural saline-alkali stress on chlorophyll content and chloroplast ultrastructure of two contrasting rice （Oryza sativa L. Japonica） cultivars[J]. Australian Journal of Crop Science， 2013， 7（2）： 289-292.

[3] Zhu J K. Plant salt tolerance[J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（2）： 66-71.

[4] Tian L， Tan L B， Liu F X， et al. Identification of quantitative trait loci associated with salt tolerance at seedling stage from Oryza rufipogon[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2011， 38（12）： 593-601.

[5] Wang X C， Chang L L， Wang B C， et al. Comparative proteomics of Thellungiella halophila leaves from plants subjected to salinity reveals the importance of chloroplastic starch and soluble sugars in halophyte salt tolerance[J]. Molecular and Cellular Proteomics， 2013， 12（8）： 2174-2195.

[6] Zarei M， Paymaneh Z. Effect of salinity and arbuscular mycorrhizal fungi on growth and some physiological parameters of Citrus jambheri[J]. Archives of Agronomy and Soil Science， 2014， 60（7）： 993-1004.

[7] 李 ?剛， 袁彩勇， 王 ?健， 等. 水稻新品種淮香粳15號豐產性、穩產性及適應性分析[J]. 福建農業學報， 2016， 31（2）： 113-117.

[8] Kronzucker H J， Szcerba M W， Schulze L M， et al. Non-reciprocal interactions between K+ and Na+ ions in barley （Hordeum vulgare L.）[J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（10）： 2793-2801.

[9] Schmidt R， Mieulet D， Hubberten H M， et al. SALT-RESPONSIVE ERF1 regulates reactive oxygen species-dependent signaling during the initial response to salt stress in rice[J]. Plant Cell， 2013， 25（6）： 2115-2131.

[10] Yamaguchi T， Blumwald E. Developing salt-tolerant crop plants： challenges and opportunities[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（12）： 615-620.

[11] 鄭崇珂， 竇玉慧， 解麗霞， 等. 水稻耐鹽相關基因的研究進展[J]. 分子植物育種， 2017， 15（11）： 4411-4422.

[12] 劉士平， 李 ?信， 汪朝陽， 等. 基因聚合對水稻稻瘟病的抗性影響[J]. 分子植物育種， 2003， 1（1）： 22-26.

[13] 郭龍彪， 程式華， 錢 ?前. 水稻基因設計育種的研究進展與展望[J]. 中國水稻科學， 2008， 22（6）： 650-657.

[14] 王彩芬， 劉冬成， 馬曉玲， 等. 水稻耐鹽基因SKC1特異性CAPS標記的開發與驗證[J]. 分子植物育種， 2015， 13（11）： 2437-2440.

[15] 李榮田， 張忠明， 張啟發. RHL基因對粳稻的轉化及轉基因植株的耐鹽性[J]. 科學通報， 2002， 47（8）： 613-617.

[16] Hou X， Xie K， Yao J， et al. A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106（15）： 6410-6415.

[17] Shibata D， Liu Y G. Technical Focus-Agrobacterium-me-diated plant transformation with large DNA fragments[J]. Trends in Plant Science， 2000， 5（8）： 354-357.

[18] 何瑞鋒， 王媛媛， 杜 ?波， 等. 水稻雙元細菌人工染色體載體系統轉化體系的建立[J]. 遺傳學報， 2006， 33（3）： 269-276.

[19] Hamilton C M， Frary A， Xu Y， et al. Construction of tomato genomic DNA libraries in a binary-BAC （BIBAC） vector[J]. Plant Journal， 1999， 18（2）： 223-229.

[20] He R F， Wang Y Y， Shi Z Y， et al. Construction of a genomic library of wild rice and Agrobacterium-mediated transformation of large insert DNA linked to BPH resistance locus[J]. Gene， 2003， 321： 113-121.

[21] Tao Q， Wang A， Zhang H B. One large-insert plant-transformation-competent BIBAC library and three BAC libraries of japonica rice for genome research in rice and other grasses[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2002， 105（6-7）： 1058-1066.

[22] Wang W， Wu Y， Li Y， et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identifi cation of stress tolerance genes[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 72（1/2）： 91-99.

[23] Hamilton C M， Frary A， Lewis C， et al. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（18）： 9975-9979.

[24] Frary A， Hamilton C M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation： an analysis in tomato[J]. Transgenic Research， 2001， 10（2）： 121-132.

[25] 楊 ?俊， 高 ?鴻， 周申遒， 等. 基于BIBAC文庫的蘆葦高分子量核DNA的制備方法[J]. 分子植物育種， 2017， 15（11）： 4578-4584.

[26] Dunning L T， Olofsson J K， Parisod C， et al. Lateral transfers of large DNA fragments spread functional genes among grasses[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2019， 116（10）： 4416-4425.

[27] Mohammed S， Samad A A， Rahmat Z. Agrobacterium-me-diated transformation of rice： Constraints and possible solutions[J]. Rice Science， 2019， 26（3）： 133-146.

[28] 劉亮亮， 唐 ?維， 喻 ?旭， 等. 根癌農桿菌介導的秈稻蜀恢527遺傳轉化方法的探究[J]. 中國農業科技導報， 2012， 14（4）： 135-141.

[29] 李朝煒， 馮 ?丹， 翟會青， 等. 農桿菌介導的旱稻遺傳轉化主要影響因素[J]. 湖北農業科學， 2014， 53（15）： 3482-3487.

[30] 孫華軍， 李國瑞， 陳永勝， 等. 農桿菌介導的植物遺傳轉化影響因素研究進展[J]. 安徽農業科學， 2015， 43（24）： 26-27， 77.

[31] Aldemita R R， Hodges T K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties[J]. Planta， 1996， 199（4）： 612-617.

責任編輯：崔麗虹

收稿日期 ?2020-06-12;修回日期 ?2020-07-17

基金項目 ?國家自然科學基金項目（No. 31660381）;國家科技支撐計劃項目（No. 2015BAD01B02-1-1）。

作者簡介 ?高 ?鴻（1994—），男，碩士，研究方向：植物生物技術與種質創新。*通信作者（Corresponding author）：馬啟林（MA Qilin），E-mail：hbhnqlm@163.com。