常壓室溫等離子體誘變選育高固氮酶活褐球固氮菌

段賽菲, 黃艷娜, 王金斌, 束仕元, 周茂超, 唐雪明*

(1.上海海洋大學食品學院, 上海 201306; 2.上海市農業科學院生物技術研究所, 上海 201106)

中國作為世界上最大的氮肥生產和消費國，農業系統中的氮肥盈余成為環境污染因子[1]，目前我國氮肥使用量遠遠超過作物最高產量需求量，過多的氮肥消耗成為環境污染的主要因素。生物固氮是工業氮肥最有效的替代品之一，可減少氮肥的使用，提高氮肥利用率，建設環境友好型農業[1]，同時能夠減少溫室氣體、酸雨及地表水和地下水的硝酸鹽污染[2]。

細菌的固氮酶能夠將空氣中的分子氮(N2)還原成氨(NH3)[3]，固氮菌通過固氮酶生物固氮可以提高全球生產力[4]。褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)是一種自生固氮菌，由于其不需要與一定的植物配合，因而具有適應性廣的特點，在氮素循環中具有重要作用，是重要的農業菌劑。已有研究證實，褐球固氮菌對春小麥[5]、枸杞[6]、棉花[7]等作物的生長有顯著促進作用，還可提高氮肥利用率[6]以及減少氮肥用量，接種褐球固氮菌可以減少50%棉花生長所需氮肥的施用量[7]。因此，褐球固氮菌在農業中具有廣泛的應用前景。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變育種技術目前在生物育種領域應用廣泛，通過育種儀產生均勻的等離子體射流對菌株進行誘變，隨著處理時間的增加會導致誘變菌株的堿基與核糖之間、堿基上的氨基以及磷酸二酯中的P-O鍵發生斷裂，將寡核苷酸鏈斷裂成小片段，最終形成多個突變位點而改變菌株的基因序列[8-9]。相對于傳統誘變方法，射流中具有化學活性的粒子能夠引發種類非常豐富的DNA損傷，最終得到大容量突變庫，大容量突變庫容易快速獲得性能優良且遺傳穩定的誘變菌株，且ARTP誘變育種技術操作簡便、安全無毒[10]。目前，ARTP已經成功應用于包括細菌、真菌和微藻在內的40多種微生物的誘變育種[10]；大腸桿菌AFP111是一種為增加琥珀酸積累而產生的自發突變體，在ARTP誘變后，獲得了具有1.33倍高的ATP產生和明顯的琥珀酸產生的突變體[11]；ε-Poly-L-lysine(ε-PL)是一種具有廣泛抗菌活性的新型食品生物保護劑，使用ARTP處理鏈霉菌(Streptomycesalbulus)孢子后，得到的突變株S.albulusA-29的產ε-PL能力是野生菌株的4倍[12]；何建華等[13]首次利用ARTP誘變草菇原生質體，得到了3株抗低溫脅迫能力比誘變前提高24 h的突變株。但目前對固氮菌株的誘變，還鮮有報道。為提高現有褐球固氮菌的固氮能力，本研究首先通過ARTP誘變出發菌株褐球固氮菌，用乙炔還原法篩選出一株高酶活突變株28s-20，經5次傳代培養確定該菌株的遺傳穩定性，并用盆栽試驗驗證其固氮效能，為提高褐球固氮菌固氮酶活性及固氮效能提供了簡便有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料褐球固氮菌CICC21686購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；‘申科糯1號’玉米種子由上海市農業科學院莊行基地提供。

1.1.2試劑蔗糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、氫氧化鈉、甘露醇、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaSO4·2H2O購自國藥集團化學試劑有限公司；Na2MoO4·2H2O、FeCl3、考馬斯亮藍G-250、結晶紫購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3培養基固氮菌種子培養基：酵母提取物0.5 g，甘露醇20.0 g，KH2PO40.2 g，K2HPO40.8 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，FeCl3微量，Na2MoO4·2H2O微量，瓊脂15.0 g，蒸餾水定容至1.0 L，pH 7.2；固體培養基每升加15.0～20.0 g瓊脂。

無氮培養基：蔗糖5.0 g，KH2PO42.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl30.005 g，CaCO30.1 g，蒸餾水定容至1.0 L，pH 7.0～7.5；固體培養基每升加15.0～20.0 g瓊脂。

1.2 儀器與設備

常壓室溫等離子體誘變儀-ⅡS(無錫源清天木生物科技有限公司)、安捷倫7890B氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、Evolution 60紫外-可見分光光度計(Thermo Fisher)。

1.3 試驗方法

1.3.1ARTP誘變菌懸液制備：取1 mL褐球固氮菌種子液至裝有100 mL固氮菌液體培養基的250 mL三角瓶中，28 ℃、200 r·min-1培養48 h，取1 mL菌液于無菌EP管中，4 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄去上清液，余下的菌體用1 mL無菌生理鹽水懸浮，稀釋至OD600為0.6～0.8。

等離子誘變處理：ARTP功率設定120 W，通氦氣載氣流速為10 L·min-1，冷卻水循環機溫度為20 ℃，將上述菌體懸浮液與10%甘油按1∶1比例混合，取10 μL均勻涂布于與誘變儀配套使用的無菌不銹鋼載片上，處理時間從0 s開始，每4 s一個遞增，至52 s。每個樣品處理結束后，不銹鋼載片會自動掉落至裝有1 mL無菌生理鹽水的2 mL無菌EP管內，待樣品全部處理完畢后取下EP管，在振蕩器上將菌體振蕩洗脫。

致死率計算：統計不同處理時間下無氮培養基平板上的菌落數，計算致死率。

式中，A指ARTP處理后平板上生長出的菌落數，B指樣品誘變處理0 s的總菌落數。

1.3.2固氮酶活性測定采用乙炔還原法[13]測定固氮酶活性，固氮菌在斜面培養基培養48 h后更換橡膠塞，向體系注入乙炔氣體，使其終濃度為10%，28 ℃繼續培養4 h，取1 mL反應氣體用氣相色譜儀測定，根據乙烯(C2H4)標準工作曲線計算乙烯生成量。菌株固氮酶活性用每毫克菌體每h將乙炔還原為乙烯的量表示，按照以下公式計算。

固氮酶活性=

式中，P為氣壓(mmHg)，t為反應溫度(℃)[14]。參考孫建光等[15]的方法用考馬斯亮藍法測定菌體蛋白量，根據牛血清白蛋白標準曲線計算菌體蛋白含量。

牛血清白蛋白標準曲線的繪制：取7只試管，分別加入濃度為0.5 mg·mL-1的牛血清白蛋白溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再依次分別加入1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL蒸餾水，每支試管加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液；振蕩搖勻各試管內液體，靜置5 min，測定595 nm處吸光值A595，以標準蛋白濃度為橫坐標，A595為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3高固氮酶活菌株篩選①平板初篩。取200 μL經過ARTP誘變、振蕩洗脫的菌液，均勻涂布在無氮固體培養基，每個時間梯度3次重復，28 ℃培養48 h，從各試驗組中的無氮培養基平板上共挑選出36個生長狀態良好、菌落較大的單菌落，對照組的菌株編號為1號，各試驗組的菌株按照挑選順序分別編號為2～37號，接種無氮培養基液體試管，28 ℃、200 r·min-1培養48 h。參照1.3.2測定36個菌株的固氮酶活性，以篩選發生正突變且固氮酶活性大幅提升的菌株。

②復篩。將篩選出的正向突變菌株轉接至無氮液體培養基28 ℃、200 r·min-1培養48 h后轉接至固氮斜面培養基，28 ℃培養48 h，參照1.3.2測定篩選菌株的固氮酶活性，驗證菌株的酶活穩定性。

1.3.4誘變菌株的遺傳穩定性分析為驗證突變株的遺傳穩定性，將復篩后獲得的最優突變株28s-20傳代培養5代，無氮固體培養基轉接至無氮固體培養基為一代，每代均接種裝有3 mL無氮培養基液體試管，28 ℃、200 r·min-1培養72 h，參照1.3.2檢測每一代菌種的固氮酶活性。

1.3.5最優突變株的生物學特性檢測將野生菌和最優突變株的種子液接種到裝有100 mL固氮菌液體培養基。

1.3.6誘變固氮菌對植物生長量的影響采用盆栽試驗，設置接種無氮培養基(對照)、接種褐球固氮菌CICC21686和突變株28s-20共3個處理，檢驗誘變固氮菌對玉米生長的影響。三角瓶中的培養基設置不同溫度梯度，分別為26、28、30、32和34 ℃，200 r·min-1培養48 h后測定OD600，每個溫度梯度3次重復；設置不同初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，28 ℃、200 r·min-1培養48 h后測定OD600，每個pH梯度3次重復。盆栽土壤取自上海市農業科學院農業試驗地，試驗前，將土壤用2 mm過篩，121 ℃滅菌1 h，待冷卻后重新滅菌，3次重復。盆栽容器為8 cm×16 cm×8 cm(高×盆口直徑×盆底直徑)，每盆裝等量干燥土。處理方法：將玉米種子用95%酒精處理5 min，傾去酒精，加入3%NaClO溶液處理2 min，傾去NaClO溶液，無菌水沖洗5次；播種玉米種子5粒，播種深度為1～2 cm，玉米兩葉一心期定苗，每盆保留長勢一致的幼苗4株；每個處理3盆，設置3組平行試驗，共27盆。試驗在上海農業科學院組織培養室進行，室內溫度28 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗。

將褐球固氮菌CICC21686和突變株28s-20在無氮培養基(CK)培養48 h，稀釋至OD600為1.5，試驗組菌劑接種量100 mL·盆-1，對照組施等量的無氮培養基，2 d接種一次，共接種7次。待幼苗生長14 d后，收獲，將植株烘干至恒重，分析植株干重及全氮量，植株全氮量由南京維百瑞生物科技有限公司測定。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft office 2010進行數據處理，采用Origin 8.5繪圖，SPSS 23.0對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘變時間的致死率

褐球固氮菌的致死率曲線如圖1所示，隨著誘變處理時間的增加，菌體的致死率不斷上升。誘變時間為12 s時，致死率達到80%以上；處理時間為20 s時，致死率相對于16 s略有下降，為77.7%，其致死率的下降可能是由于細胞啟動損傷修復機制[16]；誘變時間為24 s時，致死率又重新上升，可能是由于細胞受到的損傷超出了自身的修復能力，導致損傷無法繼續修復，從而使得致死率再次升高[17]，誘變時間為36 s及以上時，致死率達到100%。

圖1 不同誘變時間的褐球固氮菌菌株致死率曲線

2.2 突變株的篩選

2.2.1初篩菌株的固氮酶活性初篩挑選出36株突變菌株，由這些菌株的酶活性及相對于野生菌的增長率結果(圖2)可知，突變具有隨機性，且發生正負向突變與誘變時間的長短無關，各誘變組均存在正負向突變。但當誘變時間為28 s時，致死率即達到94.6%，正突變率較高，且酶活力增長率與其他誘變時間組相比增長幅度較大。表明隨著誘變致死率的升高，產生高酶活突變株的可能性越大。挑選的36株菌株中，有21株誘變株的固氮酶活高于野生菌，即58.33%的菌株發生了正向突變，其余為負向突變株，其酶活力有不同程度的降低。

圖2 誘變褐球固氮菌菌株的固氮酶活性及酶活增長率

2.2.2復篩菌株的固氮酶活性在21株正向突變株中，有10株突變株的酶活比野生菌高60%以上，為檢驗其遺傳穩定性，選擇這10株菌株重新測定酶活進行復篩。復篩結果見圖3，可知，編號28s-20突變株的固氮酶活性與初篩時相當，為(207.47±6.73) nmol·mg-1·h-1，高于野生菌101.72%。編號28s-18的菌株酶活增長率在58.94%，相較于初篩時的酶活降低了22.04%，其余菌株的固氮酶活性均有不同程度的下降，均遠低于初篩結果，表明這些菌株不具備遺傳穩定性。因此，選擇28s-20作為最優突變株并繼續檢驗其遺傳穩定性。

圖3 初篩誘變菌株的固氮酶活性及增長率

2.2.3菌株28s-20的遺傳穩定性分析 為了驗證篩選得到的最優突變菌株的遺傳穩定性，對28s-20進行傳代培養，同條件下測定發酵后的固氮酶活性，結果(圖4)顯示，隨著傳代次數的增加，固氮酶活性始終穩定在210 nmol·mg-1·h-1左右，表明突變株28s-20具有良好的遺傳穩定性。

圖4 連續培養5代的褐球固氮菌突變株的固氮酶活性

2.3 菌株28s-20的生物學特性

2.3.1最適生長溫度不同溫度的菌株生長結果見圖5，可見，當培養溫度為28 ℃時，野生株CICC21686和突變株28s-20的生長能力均最好，表明兩株菌的最佳培養溫度均為28 ℃，說明誘變對其最適生長溫度未產生影響。

注：不同小寫字母表示同一菌株不同溫度間差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.3.2最適初始pH不同初始pH的野生株CICC21686和突變株28s-20菌株的生長結果見圖6，可見，培養基初始pH在7.5左右時，28s-20的OD600最高，其生長能力最好，而pH升高或降低都會導致其生長能力下降。野生株CICC21686在pH 7.0～8.5培養時長勢相近，說明其最適pH范圍較寬，表明誘變可能提高了褐球固氮菌菌株對pH的敏感程度。

注：不同小寫字母表示同一菌株不同pH間差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.4 菌株28s-20對植物生長及其固氮效能的影響

不同菌株處理的玉米植株固氮指標結果(表1)顯示，接種野生株CICC21686和突變株28s-20的處理組與施用無氮培養基的對照組相比，植株干重及氮含量均顯著增加(P<0.05)。而且突變株28s-20的玉米植株干重和氮含量較野生株CICC21686也均顯著增加(P<0.05)，植株干重及含氮量分別增加了21.16%和34.36%。表明褐球固氮菌CICC21686和突變株28s-20均能夠增加玉米的固氮效能，突變株28s-20較野生株CICC21686的效果更好。

表1 褐球固氮菌處理的玉米生長及固氮指標

3 討論

固氮菌通過其固氮酶進行生物固氮， Niu等[18]在小麥、小白菜和荷花等植物根際共分離得到30株固氮菌，其中，菌株的固氮酶活性最高的為(38.65±30.40) nmol·mg-1·h-1。孫建光等[19]在小麥、水稻等作物中分離得到92株內生固氮菌，在純培養條件下，其固氮酶活性為0.30～254.12 nmol·mg-1·h-1，本研究獲得的褐球固氮菌菌株的固氮酶活為(207.47±6.73) nmol·mg-1·h-1，高于Niu等[18]和孫建光等[19]研究的90株固氮菌。

已有許多研究證實，ARTP誘變方法具有良好篩選效果，Zhang等[20]采用ARTP誘變技術獲得了木糖醇高產菌株，使其收獲率提高了22%，并通過進一步生化分析表明，突變體中的相對基因表達和木糖還原酶的酶活性高于原始菌株，部分解釋了木糖醇的高產率。本研究利用ARTP對褐球固氮菌進行誘變，獲得的褐球固氮菌菌株28s-20的固氮酶活性較出發菌株提高了101.72%，證實ARTP誘變對褐球固氮菌具有良好的選育效果。然而，孫建光等[15]研究認為，高固氮酶活性并不總意味著高固氮效能。因此，本研究通過玉米盆栽試驗對菌株的固氮效能進行了深入研究確認，證實褐球固氮菌的高酶活誘變株相對于野生菌能夠顯著提高玉米植株的干重和全氮量，其固氮效能可達到(38.43±0.91) mg·g-1，而蔡苗等[21]在油茶林中篩選得到的高固氮菌固氮效能最高為31.35 mg·g-1，低于本研究的固氮效能。本研究通過誘變篩選獲得高固氮酶活性且遺傳穩定的誘變株，并證實ARTP誘變能夠顯著提升其固氮效能，為提高褐球固氮菌固氮酶活性提供了有效方法。Gao等[22]通過ARTP技術誘變米曲霉(Aspergillusoryzae)3.042增強了其耐鹽蛋白酶的活性，其中，耐鹽堿性蛋白酶基因和天冬氨酰氨肽酶基因轉錄表達水平的增加，解釋了突變菌株H8中蛋白酶活性的增加應部分歸因于蛋白酶表達的增加。固氮酶復合物是生物中最復雜的金屬酶之一[23]，其通過鐵蛋白與鉬鐵蛋白一起催化N2還原為NH3[24]，關于ARTP誘變改變固氮酶活性的機制，需要進一步研究探討。