微生物降解木質(zhì)素的研究進展

楊 靜，蔣劍春，張 寧，徐 浩，解靜聰，趙 劍

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042; 2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037; 3.淮陰工學(xué)院 江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室，江蘇 淮安 223003)

木質(zhì)纖維原料是地球上最豐富、最廉價易得的可再生能源之一。木質(zhì)纖維原料主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成，其中半纖維素通過共價鍵和氫鍵與木質(zhì)素分子緊密相連，使得天然木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)非常牢固，對酶促及微生物水解等作用具有很強的抗逆性，木質(zhì)素降解成為自然界碳循環(huán)的限速步驟[1]。在生物質(zhì)生物精煉過程中，木質(zhì)素與其他組分緊密結(jié)合，干擾了木質(zhì)纖維原料的預(yù)處理過程，木質(zhì)素的降解產(chǎn)物會進一步抑制后續(xù)發(fā)酵過程，同時也會吸附水解酶[2]，成為生物質(zhì)高效利用的一大挑戰(zhàn)。與化石燃料相比，源自生物質(zhì)的生物燃料成本更高，因此基于生物質(zhì)的生物精煉面臨的主要挑戰(zhàn)是其經(jīng)濟效益。如果能將包括木質(zhì)素在內(nèi)的所有生物質(zhì)高效利用，那么就能大大提高生物質(zhì)能生物精煉的經(jīng)濟效益。自然界中木質(zhì)素的年產(chǎn)量為5～36億噸[3]。制漿和造紙業(yè)是工業(yè)木質(zhì)素的一個主要來源，每年能產(chǎn)生4 000～5 000萬噸木質(zhì)素[4]，主要以黑液形式存在，其中大部分以燃燒形式回收熱能，僅有約1.5%被轉(zhuǎn)化成高附加值的木質(zhì)素磺酸鹽或硫酸鹽木質(zhì)素等工業(yè)產(chǎn)品[5]，目前，黑液處理仍是造紙業(yè)發(fā)展的環(huán)保難題。由此可見，木質(zhì)素的高效資源化利用可以顯著提高木質(zhì)纖維素生物煉制的經(jīng)濟可行性，同時有利于環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[6]。從20世紀80年代起，國內(nèi)外對木質(zhì)素的高效降解研究表明，木質(zhì)素可通過物理、化學(xué)、物理-化學(xué)等方法降解，但大多數(shù)方法都需要嚴苛的操作條件、高耗能、高成本，以及存在降解過程中會產(chǎn)生抑制物影響后續(xù)的酶解、發(fā)酵過程等問題。生物預(yù)處理因具有低能耗、無化學(xué)藥品添加以及對環(huán)境友好的優(yōu)勢被認為是一種極具潛力的生物質(zhì)預(yù)處理方法[7]。作者綜述了近年來降解木質(zhì)素的微生物以及木質(zhì)素降解酶的最新進展，并介紹了木質(zhì)素生物降解煉制工業(yè)化產(chǎn)品的研究現(xiàn)狀，以期為木質(zhì)素的高效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)

木質(zhì)素是一種復(fù)雜的、無定型、三維長鏈高分子化合物，由苯丙烷單體聚合而成。由于甲氧基數(shù)量不同可將這些單體分為松柏醇(G型)、芥子醇(S型)和對香豆醇(H型)。不同生物質(zhì)原料的木質(zhì)素組成單元也不同，軟木木質(zhì)素含有較高G單元(80%～90%)，而硬木木質(zhì)素含有25%～50%的G單元和50%～70%的S單元，草本木質(zhì)素則含有這3種芳香單元的混合物(G型25%～50%，H型10%～25%，S型25%～50%)[8]。草本植物含木質(zhì)素量最低(10%～19%)，軟木和硬木的木質(zhì)素量較高，含木質(zhì)素分別為25%～35%和18%～25%[9]。

木質(zhì)素各單元的直接連接鍵包括碳碳鍵和醚鍵，其中50%～80%為醚鍵，代表鍵型有β-O- 4、α-O- 4 和4-O-5；20%～35%為碳碳鍵，代表鍵型為β-5、β-1和5-5等[10]。木質(zhì)素的反應(yīng)活性受酚羥基、羰基、非環(huán)芐醚、甲氧基和脂肪族羥基等不同官能團的影響[11]。識別各種木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)組成以及天然連接鍵對于木質(zhì)素高效轉(zhuǎn)化可再生燃料、材料或化學(xué)品非常重要。

2 降解木質(zhì)素的微生物

2.1 真 菌

木質(zhì)素是一種多酚、難降解有機聚合物，具有交聯(lián)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，無法像纖維素和半纖維素一樣通過降解酶直接降解。盡管如此，有些微生物仍能通過氧化酶反應(yīng)形成自由基和氧化還原介質(zhì)，作用于木質(zhì)素。能夠降解木質(zhì)素的微生物主要包括真菌和細菌。同時，真菌是一種主要的木質(zhì)素降解微生物。目前對真菌中的白腐菌和褐腐菌降解木質(zhì)素的研究最為廣泛和深入，并已應(yīng)用到酚類化合物的生物修復(fù)、生物制漿以及木質(zhì)素產(chǎn)物精煉等領(lǐng)域[12]。在降解酶系組成及調(diào)控、降解酶基因工程以及降解機理等方面取得了一定的進展。白腐菌的木質(zhì)素降解能力遠遠優(yōu)于褐腐菌[13]。褐腐菌首先攻擊纖維素，而白腐菌則通過各種酶攻擊木質(zhì)素和纖維素[14]。白腐菌對木質(zhì)素的降解有選擇性和非選擇性兩種途徑。在選擇途徑中，白腐菌優(yōu)先降解木質(zhì)素，保留底物中較多的碳水化合物，而留下大部分纖維素，但非選擇性途徑則同時水解多糖和木質(zhì)素[15]。黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脈側(cè)菌(Phlebiaradiata)、污叉絲孔菌(Dichomitussqualens)等白腐菌均具有較強的木質(zhì)素降解活性。褐腐菌只能部分降解木質(zhì)素，使木質(zhì)素芳香環(huán)結(jié)構(gòu)保持不變，碳水化合物被去除，留下深褐色的木質(zhì)素殘留，但是木質(zhì)素會通過芳香環(huán)的去甲基化或引入新的羰基和羧基而被氧化[16]。

2.2 細菌

雖然目前對真菌降解木質(zhì)素的研究最為廣泛和深入，但是真菌降解木質(zhì)素存在預(yù)處理周期長、對環(huán)境適應(yīng)性差，以及易于被孢子污染等問題[17]，仍需要探索更好的生物降解木質(zhì)素途徑。由于細菌具有極強的環(huán)境適應(yīng)性及生物多樣性，關(guān)于細菌降解木質(zhì)素的研究也逐漸受到關(guān)注。近些年的研究證實細菌也能夠分泌木質(zhì)素降解酶，也是自然界木質(zhì)素降解過程的重要參與者[18-19]。與真菌相比，細菌繁殖迅速、環(huán)境適應(yīng)能力強、易于工業(yè)化應(yīng)用；基因組較小，基因操作和關(guān)鍵酶的大規(guī)模重組表達更容易進行。研究表明，細菌可通過多種途徑降解芳香物質(zhì)，如單酚類、復(fù)雜的木質(zhì)素及相關(guān)衍生物質(zhì)[20]，在高濕度和低氧含量條件下，能夠降解硬木和軟木[21]，有望成為木質(zhì)素大規(guī)模轉(zhuǎn)化和利用的突破口。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者從白蟻腸道、牛胃、土壤和堆肥等材料中分離出多種具有木質(zhì)素降解能力的細菌(表1)。

表1 可降解木質(zhì)素的細菌

相比真菌降解木質(zhì)素，細菌的另一個優(yōu)勢是能夠適應(yīng)低氧環(huán)境，這對某些工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域來說意義重大[10]。 目前關(guān)于木質(zhì)素厭氧降解的研究還比較少，但仍有一些研究證實某些厭氧菌能夠降解木質(zhì)素衍生甲氧基單芳香族化合物(香草酸和丁香酸)生成甲烷和二氧化碳[28]。脫硫微菌(Desulfomicrobiumsp.)是一種嚴格厭氧細菌，能夠利用硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽作為自身電子受體參與木質(zhì)素的降解[28]。研究人員從熱帶森林土壤中分離到了兼性厭氧菌甲苯單胞菌屬(Tolumonaslignolytica)[29]和克雷伯氏菌(Klebsiellasp. )[30]，能夠利用木質(zhì)素作為碳源和能源生長。此外，食氣梭菌(Clostridiummethoxybenzovorans)[31]、甲烷食甲基菌(Methanomethylovorans)[32]、腸桿菌(EnterobacterlignolyticusSCF1)[33]、紅球菌(Rhodococcusjostii)[34]等均證實具有厭氧降解木質(zhì)素的潛力。Xu等[35]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在微氧條件下能夠分泌過氧化物酶，經(jīng)過24 h微氧發(fā)酵，玉米秸稈木質(zhì)素降解率可達23%，證實該菌在微氧條件下可快速高效降解木質(zhì)素。當枯草芽孢桿菌漆酶(CotA)基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達時，微氧環(huán)境有利于細胞積累合成漆酶所需的銅；而當供氧充足時，細胞無法獲得足夠的銅離子，導(dǎo)致無法合成完整漆酶[36]。天然木質(zhì)素在厭氧條件下的降解速率緩慢，但是，高度甲氧基化木質(zhì)素和可溶性木質(zhì)素的降解相對容易[37]。關(guān)于厭氧降解木質(zhì)素的機理還不清楚，但研究人員發(fā)現(xiàn)甲氧基芳烴(丁香酚)的厭氧降解分為3個步驟：1) 甲氧基化的芳香分子發(fā)生去甲基化，在此過程中，甲氧基化的芳香分子中的甲基被重新移動；2) 去甲氧基化芳香結(jié)構(gòu)被打開并轉(zhuǎn)化為乙酸、氫和二氧化碳；3) 進一步轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳[38]。為了提高木質(zhì)素的工業(yè)利用，厭氧微生物降解木質(zhì)素將更具競爭力，并可在生物燃料、廢水處理等領(lǐng)域發(fā)揮作用。

3 降解木質(zhì)素的酶及其降解機制

木質(zhì)素的三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)不能被低氧化/還原電位的氧化還原酶降解。通常，木質(zhì)素需要通過解聚轉(zhuǎn)換成可被微生物利用的小分子單元，這些小分子單元被微生物通過各種酶代謝成中間代謝產(chǎn)物，隨后轉(zhuǎn)化成聚羥基烷酸酯、聚乳酸等生物聚合物[39]。而木質(zhì)素分解菌可產(chǎn)生細胞外氧化酶，這些酶通過形成高度活躍的自由基，通過氧化反應(yīng)降解木質(zhì)素。這些自由基通常具有很高的氧化/還原電位，并能進一步打開芳香環(huán)。除了芳香環(huán)裂解外，自由基還能進一步使芳香環(huán)脫甲氧基化[40]。

3.1 過氧化物酶

一般來說，真菌和細菌的木質(zhì)素降解活性依賴于氧化酶(漆酶和過氧化物酶)和其他一些輔助酶，如H2O2酶。根據(jù)催化反應(yīng)類型，過氧化物酶可分為錳過氧化物酶(MnP)、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、多功能過氧化物酶(VP)和染料脫色過氧化物酶(DyP)[4]。MnP是一種胞外血紅素蛋白，具有Mn2+活性中心。反應(yīng)時Mn2+被氧化生成Mn3+，擴散或滲透到植物細胞內(nèi)部，然后Mn3+氧化苯酚生成苯氧殘基[16]。MnP的氧化/還原電位較低，只能氧化降解酚型木質(zhì)素[4]。LiP可被H2O2激活，從苯環(huán)結(jié)構(gòu)獲得一個電子，發(fā)生單電子氧化反應(yīng)形成苯氧自由基，隨后通過鏈式反應(yīng)產(chǎn)生其他類型的自由基，導(dǎo)致側(cè)鏈中的主要化學(xué)鍵斷裂[41]，LiP的氧化/還原電位極高，能夠獨自氧化非酚型的木質(zhì)素。而VP則結(jié)合了MnP和LiP的催化降解策略，被認為是第三類木質(zhì)素降解過氧化物酶[40]。DyP在結(jié)構(gòu)上與其他過氧化物酶不同，其具有廣泛的底物作用范圍，主要在酸性pH值下活躍，該酶可能同時具有氧化和水解作用[42]。

3.2 漆酶

漆酶(Lac)是一種多酚氧化酶，屬于藍色多銅氧化酶家族，具有廣泛的催化底物，主要包括酚類、芳胺類、羧酸類、甾體類化合物[43]。大多數(shù)漆酶均具有一個單核中心(T1Cu)和一個三核中心(T2Cu 和T3Cu)，結(jié)合有4個銅離子，形成特定構(gòu)型的三核銅簇活性中心。細菌漆酶的氧化/還原電位較低，擔子菌白腐真菌的氧化/還原電位相對較高且具有更強的催化活性，在木質(zhì)素降解中起主要作用。但是細菌漆酶對溫度、pH值的耐受性更強，更適于工業(yè)化應(yīng)用[44]。據(jù)報道，真菌漆酶耐受pH值3.0～7.0，溫度20～50 ℃，而細菌漆酶耐受pH值1.0～7.2，溫度30～85 ℃[4]。 地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、亞硝酸單胞菌(Nitrosomonaseuropaea)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)和嗜熱細菌(Thermusthermophilus)都顯示具有漆酶活性，并且大部分細菌漆酶基因主要分布在鏈霉菌和芽孢桿菌目[45]。

3.3 降解機制

到目前為止，研究的所有微生物其降解木質(zhì)素的整體機制具有顯著的相似性。總體來說，多種高活性氧化酶參與強氧化還原過程，產(chǎn)生自由基或氧化還原介質(zhì)[39]，與酶相比這些活性分子更小，可以進入木質(zhì)素的三維結(jié)構(gòu)，并在分子內(nèi)形成化學(xué)鍵。隨后木質(zhì)素降解化合物被特定的微生物攻擊，進一步降解、修飾或最終打開芳香環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1)。木質(zhì)素最終降解產(chǎn)物取決于可用的電子受體。在好氧環(huán)境中是CO2，而在不同的厭氧環(huán)境中可能是H2S、NH4或甲烷[15]。木質(zhì)素的降解途徑主要包括部分水解，芳香基、烷基醚、醚鍵和C—C鍵的斷裂，脫甲氧基化、烷化和縮合反應(yīng)。其中，Cα—Cβ鍵的斷裂較容易，同時β-O- 4醚鍵先于其他鍵斷裂。在較低溫度的溫和條件下，醚鍵和C—C鍵斷裂，生成酚類單體化合物和二聚化合物[46]。

圖1 木質(zhì)素微生物降解模型[10]

4 微生物降解木質(zhì)素的工業(yè)應(yīng)用

相比于物理化學(xué)方法，生物降解通常在溫和的條件下進行，有利于產(chǎn)品的選擇性和環(huán)境友好性。其中以白腐菌和褐腐菌為代表的真菌降解木質(zhì)素已應(yīng)用到酚類化合物的生物修復(fù)、生物制漿以及木質(zhì)素產(chǎn)物精煉等領(lǐng)域[4]，木質(zhì)素降解細菌則可用于制漿造紙廢水處理、聚羥基烷酸酯(PHA)、脂質(zhì)生物燃料、食品添加劑香蘭素、生物肥料等的生產(chǎn)。

4.1 脂類

微生物可將木質(zhì)素轉(zhuǎn)化為油脂，成為生產(chǎn)生物柴油的原料。紅球菌可通過β-酮己二酸途徑代謝木質(zhì)素基化合物合成脂質(zhì)。紅球菌 RHA1可通過苯乙酸(PAA)途徑利用輔酶A (CoA)實現(xiàn)芳香酸的衍生化，而不需要開環(huán)催化。這使得芳香衍生的碳元素可穿梭進入CoA，成為脂肪酸合成和脂質(zhì)積累的必要前體[47]。同時木質(zhì)素衍生的芳香族小分子化合物更容易被微生物代謝，因此適當?shù)念A(yù)處理有利于微生物脂質(zhì)的積累。皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)[48]、虎皮香菇(Lentinustigrinus)[49]等產(chǎn)油酵母和真菌也能夠利用木質(zhì)素積累油脂。

4.2 生物塑料

聚羥基烷酸酯(PHA)是一種可由微生物合成的可降解聚合物，在涂料、薄膜、生物醫(yī)用材料、生物相容性給藥材料、有機/無機復(fù)合材料等方面具有廣泛的應(yīng)用，可作為傳統(tǒng)化石來源塑料的替代品[50]。雖然真菌是木質(zhì)素高效降解的優(yōu)勢微生物，但是真菌缺乏PHA合成相關(guān)酶。細菌包括貪銅菌(Cupriavidusbasilensis)[51]、真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstoniaeutropha)[52]、惡臭假單胞菌[53]和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatherium)[4]等均被報道具有以木質(zhì)素及其衍生物合成PHA的能力。其中，惡臭假單胞菌KT2440可通過相關(guān)代謝途徑將芳香類化合物轉(zhuǎn)化為PHA，該菌可利用木質(zhì)素基芳香族化合物合成長鏈PHA，并已進行中試生產(chǎn)[53]。

4.3 香蘭素

香蘭素(3-甲氧基- 4-羥基苯甲醛)是一種重要香料，廣泛應(yīng)用于食品添加劑、日用品、保健品等領(lǐng)域。利用木質(zhì)素衍生產(chǎn)品生產(chǎn)香蘭素已得到廣泛的研究。鏈霉菌V-1被認為是最具發(fā)展前景的香蘭素生產(chǎn)菌之一，可利用阿魏酸為底物合成香蘭素。此外，紅球菌、枯草芽孢桿菌、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)[54-56]等細菌能代謝米糠、竹片、阿魏酸合成香蘭素。通過基因工程可以提高香蘭素的產(chǎn)量。已研究發(fā)現(xiàn)刪除紅球菌RHA1Δvdh基因、惡臭假單胞菌 GN299 lapABC 操縱子(GN23)有助于香蘭素的積累[57]。 鏈霉菌中的fcs和ech基因也被證實是香蘭素合成的關(guān)鍵基因，當將這兩種基因在大腸桿菌體內(nèi)表達時，10 h內(nèi)阿魏酸到香蘭素的轉(zhuǎn)化率可達94.3%[58]。

4.4 廢水處理

制漿造紙工業(yè)產(chǎn)生了大量含有木質(zhì)素的黑液，直接排放會造成環(huán)境污染，并對水生動植物產(chǎn)生危害[4]。為了處理黑液，大部分造紙廠需要建立專門的廢水處理工段，需要消耗大量的化學(xué)藥品且運行費用昂貴。采用細菌、真菌等微生物處理方法，可將黑液中的木質(zhì)素轉(zhuǎn)化成乙二醇、對羥基苯甲酸、香草酸等高附加值化學(xué)品，使得黑液的預(yù)處理更加經(jīng)濟和環(huán)保[59]。相比單菌培養(yǎng)，混菌共培養(yǎng)可有效降低黑液的色度以及化學(xué)需氧量(COD)等污染參數(shù)[60]，并且GC-MS分析表明處理后木質(zhì)素分子質(zhì)量降低，說明菌群能夠利用木質(zhì)素成分作為碳源生長[61]。

偶氮染料是紡織工業(yè)使用的主要染料，具有抗酸、抗堿、抗光、抗微生物降解等特性，是毒性大且難降解的芳香類化合物之一[62]。細菌木質(zhì)素降解酶如木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、染料脫色過氧化物酶(DyP)和漆酶等證實具有降解偶氮染料和其他紡織染料的能力[63]，其中DyP的降解能力要優(yōu)于其他酶。嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)分泌的DyP能夠降解大多數(shù)染料[64]。而來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PKE117的重組DyP過氧化物酶(DyPPa)在酸性條件下能夠降解多種蒽醌染料[65]。沙鏈霉菌 (Streptomycespsammoticus)分泌的漆酶也被報道能夠在短時間內(nèi)使得雷瑪唑亮藍色度降低80%[66]。

5 結(jié)語與展望

作為地球上最豐富的可再生芳香化合物，木質(zhì)素的解聚與利用對自然界碳循環(huán)意義重大。微生物介導(dǎo)的木質(zhì)素降解途徑因其低能耗、對環(huán)境友好等優(yōu)點成為研究的熱點。由于具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性以及便于遺傳操作，細菌成為木質(zhì)素解聚的新手段，并將成為木質(zhì)纖維原料預(yù)處理、木質(zhì)素資源化利用及廢水處理的重要候選菌種。未來研究需要挖掘更多的新型木質(zhì)素降解菌株，特別是厭氧或微氧等條件，可能成為新菌株的篩選來源并揭示木質(zhì)素解聚和轉(zhuǎn)化的新機制。盡管研究報道認為微生物能夠?qū)⒛举|(zhì)素轉(zhuǎn)化成多種具有工業(yè)應(yīng)用價值的化學(xué)品，但是目前的難點是產(chǎn)物得率較低。未來可通過擴大目標菌株篩選范圍、代謝工程抑制副產(chǎn)物合成、基因工程構(gòu)造木質(zhì)素高效重組菌等手段，實現(xiàn)木質(zhì)素細菌降解產(chǎn)業(yè)化。