低魚粉飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒生長性能體成分及肌肉氨基酸組成的影響

王亞玲 王常安 劉紅柏 陸紹霞 張 穎 徐 喆

(1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 2150070；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 2201306；3.南京農業大學無錫漁業學院，無錫 2214000)

蛋白質是魚類飼料中最重要也是最昂貴的成分[1]。從本質上講，動物對蛋白質的需求實質是對氨基酸的需求，蛋白質中的氨基酸主要影響魚類的生長發育、正常的生理功能、氮的代謝和排泄以及魚類的健康[2-3]。而氨基酸只能直接或間接從食物中獲取，當飼料蛋白質中的1種或數種必需氨基酸不足時，魚類利用飼料蛋白質的效率降低，正常的生理功能受阻，影響生長和發育[4]。魚粉因其具有蛋白質含量高，長鏈脂肪酸、必需氨基酸、維生素和礦物質含量豐富等優點，一直以來都是水生動物的優質蛋白質源之一[5]，但是近幾年來，由于日益高漲的價格和有限的魚粉資源，使得水生動物的魚粉用量不得不減少[6-7]。常用植物蛋白質源替代魚粉，如玉米蛋白粉、小麥面筋、豆粕、菜籽粕等，但往往出現必需氨基酸缺乏或含量很低，容易引起飼料中氨基酸不平衡，從而導致水生動物不能高效利用飼料蛋白質或氨基酸，影響機體的相關代謝[8-9]。蘇氨酸為高梁[10]和小麥粉[11]的第二限制性氨基酸，玉米的第三限制性氨基酸[12]，逐漸成為影響魚類生長性能的限制性氨基酸。當缺乏蘇氨酸造成氨基酸不平衡時，即使添加其他氨基酸，也很難提高生長性能[13-15]。在鯉魚(Cyprinuscarpio)[16]、遮目魚(Chanoschanos)[17]的研究中發現蘇氨酸缺乏時，死亡率升高；在乳豬蘇氨酸不足或缺乏時，會引起生理失衡以及與蛋白質合成和能量代謝相關基因的變化；在陸生動物如家禽、豬和牛上也有大量蘇氨酸缺乏癥相關報道[18-20]。因此，進一步研究蘇氨酸顯得尤為重要[21]。

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)屬鮭形目(Salmoniformes)，鮭科(Salmonidae)，大麻哈魚屬(Oncorhynchus)，因其富含不飽和脂肪酸、蛋白質含量較高、易加工、無肌間刺等特點，成為各國受歡迎的健康食品。三倍體虹鱒是基于遺傳特性和生產實踐而產生的多倍體虹鱒，與普通二倍體相比具有生長速度快、個體大、抗病性強、肉質細膩和養殖周期短等優勢，成為世界上最為廣泛的養殖魚類之一，國內占世界虹鱒養殖量的80%以上[22-23]。目前，虹鱒和鮭鱒對蘇氨酸的需求量已有研究報道[24-25]，研究發現虹鱒和大西洋鮭在魚苗階段對蘇氨酸的需求量相似[26]，然而在低魚粉飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒的研究較少。因此，本試驗旨在研究低魚粉飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒生長性能、體成分及氨基酸組成的影響，為三倍體虹鱒人工高效配合飼料的配制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎飼料為半純化飼料，以糊精為糖源，魚粉、豆粕、明膠為蛋白質源，魚油、豆油和磷脂為脂肪源配制粗蛋白質水平為41.54%，粗脂肪水平為18.68%的基礎飼料[27]。在基礎飼料中分別添加不同水平的L-蘇氨酸(Sigma，純度98%)，配制蘇氨酸水平分別達到0.45%(G1，對照)、0.76%(G2)、1.09%(G3)、1.29%(G4)、1.64%(G5)的5種等氮等脂的試驗飼料，其組成及營養水平見表1，其中蘇氨酸水平的增減用等量的甘氨酸代替，試驗飼料氨基酸組成見表2。所有原料粉碎后經過80目篩，按照配方稱重，逐級混合均勻后經小型制粒機HKJ-218(無錫同力糧機有限公司)加工成直徑為3 mm的顆粒飼料，風干后裝袋，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(干物質基礎)

續表1項目 Items飼料 DietsG1G2G3G4G5合計 Total100.00100.00100.00100.00100.00營養水平 Nutrient levels4)總能 Gross energy/(MJ/kg)5.075.075.075.075.07粗蛋白質 Crude protein41.5441.5441.5441.5441.54粗脂肪 Crude lipid18.6818.6818.6818.6818.68

表2 試驗飼料氨基酸組成(干物質基礎)

1.2 試驗魚及養殖條件

試驗在中國水產科學研究院黑龍江水產研究所進行。在試驗開始時，選取同一批魚苗，放入水族箱中適應2周，在適應期間，基礎飼料(G1)飽食投喂，使之能夠逐漸適應養殖環境和試驗飼料。試驗開始時，試驗魚饑餓24 h，選取初始體質量為(18.42±0.20) g、規格一致的健康三倍體虹鱒隨機分配到15個200 L的流水水族箱中。試驗分為5組，每組3個重復，每個重復30尾試驗魚，分別飼喂G1、G2、G3、G4、G5飼料，每天投喂2次(09：00和16：00)，達飽食，養殖周期56 d。試驗期間自然光照，水源為曝氣自來水，水溫(15±1) ℃，溶氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量<0.2 mg/L，pH 7.0～7.2，每天記錄投飼量，如有死魚稱重并記錄數量。

1.3 采樣及測定

1.3.1 采樣

養殖試驗結束后，虹鱒饑餓24 h，分別從每個水族箱中隨機取3尾虹鱒，每組9尾，用100 mg/L MS-222麻醉，測體長，稱量體重，用于全魚常規養分含量的測定；再從每個水族箱中隨機取4尾魚，放置冰盤上，取背肌于速凍管中，放置到液氮中用于肌肉氨基酸組成的測定，采樣編好號后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.3.2 生長性能的測定

生長性能指標計算公式如下：

增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×

(Wt-W0)；
特定生長率(specific growth rate，SGR，%/d)=
100×(lnWt-lnW0)/t；
蛋白質效率(protein efficiency ratio，PER)=(Wt-
W0)/(Wf×飼料蛋白質含量)。

式中：W0為魚初始體質量(g)；Wt為魚終末體質量(g)；Lt試驗魚終末體長(cm)；Wf為飼料攝入量(g)；t為試驗天數(d)。

1.3.3 營養成分含量的測定

采用烘干法(GB/T 6435—2014)，在(105±1) ℃、1個大氣壓下，在烘箱中烘干直至恒重，測定樣品中水分的含量；采用半自動微量凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)測定粗蛋白質含量；采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006)，以乙醚為抽提劑測定粗脂肪含量；采用灼燒法(GB/T 6438—2007)，在馬弗爐(550 ℃)充分灼燒測定粗灰分含量。

1.3.4 肌肉氨基酸組成的測定

魚體肌肉中氨基酸組成采用全自動氨基酸分析儀(日立L-8900)測定。稱量冷凍干燥好的肌肉樣品40～50 mg(精確至0.1 mg)，放置50 mL的安瓿瓶中并做好標記；加入6 mol/L鹽酸10 mL，迅速封管后放置恒溫干燥箱(110±1) ℃中水解24 h，冷卻后打開安瓿瓶；用超凈水定容到150 mL旋轉蒸發瓶內，在旋轉蒸發器(60 ℃)中抽真空，蒸發至干；用0.02 mol/L的鹽酸沖洗蒸發瓶數次，洗滌液轉至10 mL容量瓶中，最后用0.02 mol/L的鹽酸定溶，充分混勻后即為試樣水解液。吸取試樣水解液及混合氨基酸標準液2～3 mL，經過濾至自動進樣瓶中并加蓋，通過全自動氨基酸分析儀進行氨基酸含量的檢測。

1.4 統計分析

使用統計軟件SPSS 23.0進行單因素方差分析，經過單因素方差分析后，使用Duncan氏法對數據之間的差異性進行多重比較，所有的試驗數據結果采用平均值±標準差表示，以P<0.05為顯著差異性標準。使用Excel 2013軟件，以特定生長率、蛋白質效率為評價指標進行二次回歸分析，確定三倍體虹鱒對蘇氨酸的最佳需要量范圍。

2 結果與分析

2.1 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒生長性能的影響

由表3可見，試驗結束時，各組間虹鱒的飼料系數、蛋白質效率差異不顯著(P>0.05)，3個試驗組虹鱒的終末體質量、增重率和特定生長率相比對照組顯著升高(P<0.05)，肥滿度在G4組最低，G1組最高，2組間差異顯著(P<0.05)。

表3 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒魚生長性能的影響

如圖1、圖2所示，以飼料中不同蘇氨酸水平為自變量(X)，分別以特定生長率和蛋白質效率進行二次回歸分析，得出：特定生長率與蘇氨酸水平之間的回歸方程為y=-0.193 7x2+0.509 6x+1.573 9(R2=0.984 7)；蛋白質效率與蘇氨酸水平之間的回歸方程為y=-0.1x2+0.239 6x+1.957 8(R2=0.882 0)。如圖1、圖2所示，當飼料蘇氨酸水平低于1.3%時，三倍體虹鱒的特定生長率隨飼料蘇氨酸水平的提高呈上升的趨勢，當飼料蘇氨酸水平高于1.3%時，特定生長率呈下降的趨勢；當飼料蘇氨酸水平低于1.2%時，三倍體虹鱒的蛋白質效率隨飼料蘇氨酸水平的提高呈上升的變化趨勢，當飼料蘇氨酸水平高于1.2%時，蛋白質效率呈下降的變化趨勢；當蘇氨酸水平為1.2%、1.3%時，三倍體虹鱒的特定生長率和蛋白質效率均有最大值，分別為1.91 %/d、2.10%。

圖1 飼料蘇氨酸水平和虹鱒特定生長率的回歸分析

圖2 飼料蘇氨酸水平和虹鱒蛋白質效率的回歸分析

2.2 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒體成分的影響

由表4可見，隨著飼料蘇氨酸水平的增加，虹鱒全魚水分含量有顯著變化(P<0.05)，其中G5組顯著低于對照組(P<0.05)；粗蛋白質含量隨著飼料蘇氨酸水平的升高呈先升高后降低的變化趨勢；G4組的粗脂肪含量顯著低于其余各組(P<0.05)；粗灰分含量各組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒體成分的影響

2.3 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒肌肉氨基酸組成的影響

由表5可見，三倍體虹鱒體內氨基酸組成十分豐富，共檢測到17種氨基酸，飼料中蘇氨酸水平對三倍體虹鱒肌肉蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)含量無顯著影響(P>0.05)外，對纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)含量有顯著影響(P<0.05)，其中谷氨酸的含量最高，天冬氨酸含量次之，其他氨基酸在G4組的含量相對較高，絲氨酸含量顯著增高(P<0.05)，半胱氨酸含量顯著降低(P<0.05)。

表5 飼料中添加蘇氨酸對虹鱒肌肉氨基酸組成的影響(干物質基礎)

3 討 論

3.1 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒生長性能的影響

本試驗中，投喂蘇氨酸缺乏的飼料(蘇氨酸水平為0.45%)后發現，三倍體虹鱒的生長緩慢，類似的現象在大西洋鮭(Salmosalar)[28]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[29]、歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[30]、南亞野鱗(Catlacatla)[31]等魚類上都有報道。當飼料中蘇氨酸水平不足時，虹鱒的生長受阻，導致增重率和特定生長率的數值相比均偏低，當飼料中的蘇氨酸水平提高到1.29%，虹鱒的生長狀況將得到改善，增重率、特定生長率有顯著提高。這說明當飼料中蘇氨酸缺乏時會導致蛋白質合成受阻，影響正常的生長發育，也有可能影響抗氧化產物的減少，導致生長進一步加劇停滯。在低魚粉且蘇氨酸缺乏的條件下，將蘇氨酸補充到適宜水平可以改善三倍體虹鱒的生長性能。以特定生長率、蛋白質效率為評價指標，得出三倍體虹鱒對蘇氨酸的最適需要量為1.35%～1.48%(占飼料蛋白質的2.89%～3.13%)，按其占蛋白質含量的比較，這一結果與鮭科魚類如狗大馬哈魚(Oncorhynchusketa)[32]和大西洋鮭(Salmosalar)[33]的3.0%～3.2%相似，高于鮭科魚類的大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[34]、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch)[35]的2.0%～2.2%；但低于印度鯉魚(Cirrhinusmrigala)[36]、印鯪(Labeorohita)[37]、遮目魚(Chanoschanos)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[38]的研究結果(4.30%～4.66%)，有研究學者通過生長試驗指出虹鱒的蘇氨酸需要量為1.52%(占飼料蛋白質的3.4%)[39]，與本試驗相比，三倍體虹鱒蘇氨酸需要量(2.89%～3.13%)比虹鱒的需要量略低，上述研究所得蘇氨酸需要量不同可能是由于試驗魚的種類和大小、基礎飼料組成(純化、半純化、實用飼料等)、晶體氨基酸、試驗設計和養殖條件等多個原因造成差異[40-41]。例如，本試驗中的試驗魚是三倍體虹鱒，飼料中添加的是15%的魚粉，另外，蘇氨酸的吸收率、添加形式和生物利用效率也會影響其需要量[42]。當飼料中蘇氨酸水平達到或超過1.29%時，之后在飼料中進一步添加蘇氨酸，三倍體虹鱒的增重率、肥滿度、特定生長率和蛋白質效率的增加速率將有所降低，這與草魚(Ctenopharyngodonidella)[43]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[44]的研究結果一致。推測可能是蘇氨酸過量時因排泄和脫氨作用使飼料氨基酸模式不平衡，導致魚類生長與蛋白質沉積降低，此外，氨對生物體有毒，脫去的氨需要排出體外，消耗額外的能量，引起特定生長率下降[45-46]。然而，也有研究報道，飼料蘇氨酸水平升高到適宜水平后魚體的特定生長率顯著增加，繼續升高蘇氨酸水平，特定生長率基本保持不變，后趨于平穩的趨勢[47]。

3.2 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒體成分的影響

本試驗中，隨著飼料蘇氨酸水平的增加，虹鱒全魚的水分含量顯著降低，在G5組的水分含量最低；G4組的粗脂肪含量最低；粗蛋白質含量隨著飼料蘇氨酸水平的增加呈現先增加后降低的變化趨勢；粗灰分含量隨著飼料蘇氨酸水平的增加無顯著變化。胡曉霞等[48]對生長中期草魚(Ctenophyngodonidellus)投喂含不同水平蘇氨酸的飼料，發現蘇氨酸水平能顯著降低生長中期草魚的水分和粗脂肪含量，極顯著提高粗蛋白質的含量。周興華等[49]對吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究發現，飼料中蘇氨酸水平適宜時，不同水平的蘇氨酸會顯著降低吉富羅非魚的水分含量，而粗蛋白質含量顯著增高，對粗脂肪和粗灰分含量影響不顯著，這與建鯉(Cyprinuscarpiovarjian)[50]、印度鯰魚(Silurusasotus)[51]、日本對蝦(Penaeussemisulcatus)[52]的研究結果一致，隨著飼料蘇氨酸水平的增加，體蛋白質含量增加，當蘇氨酸水平為1.58%時，體蛋白質含量最高。本試驗與其結果相似，說明飼料蘇氨酸水平添加不足時，飼料中氨基酸模式出現失衡的現象，使體蛋白質合成受阻，最終導致三倍體虹鱒限制利用其他氨基酸的能力，加重多余氨基酸的脫氨基作用，主要利用蛋白質而不是脂肪作為能源，而添加適宜水平的蘇氨酸后，增加了三倍體虹鱒對蘇氨酸的利用，促進了體蛋白質的合成，使更多的脂肪用于能量消耗。

3.3 飼料中添加蘇氨酸對三倍體虹鱒肌肉氨基酸組成的影響

魚類對蛋白質的積累實質是通過飼料氨基酸的合成來實現的，飼料的氨基酸模式不同，對魚類蛋白質的合成、體蛋白質結合態氨基酸的組成以及魚類生長的影響都不同。牙鲆(Paralichthysolivaceus)飼料添加蘇氨酸的研究發現，飼料蘇氨酸水平與全身精氨酸、蘇氨酸和纈氨酸含量呈正相關關系[53]。虹鱒飼料蘇氨酸水平升高后，降低了全身賴氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量，增加了全身組氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸的含量[26]。隨著飼料中添加蘇氨酸水平提高，增加了大西洋鮭全身精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸的含量[28]。本試驗結果與其相似，隨著飼料中蘇氨酸水平的增加，對肌肉纈氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸含量有顯著影響，其中絲氨酸含量顯著增加，半胱氨酸含量顯著降低，其他氨基酸含量呈現先增加后降低的變化趨勢。這表明攝入一種氨基酸可能會影響其他氨基酸含量的改變[42]，飼料中必需氨基酸的某一種限制可能會增加其他必需氨基酸或非必需氨基酸的氧化來達到飼料中氨基酸的平衡[54]。

4 結 論

飼料中添加蘇氨酸可以提高三倍體虹鱒的生長性能，以特定生長率、蛋白質效率為評價指標，經過二次回歸分析可知，三倍體虹鱒對蘇氨酸的最佳需要量為1.2%～1.3%。