超聲引導下兩種肝癌模型建立效果的比較分析

汪德兵， 楊鵬， 黃智， 許敏， 王黎洲， 周石

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見惡性腫瘤，目前，隨著診療技術進步，HCC早期檢出率有所提高[1]，但有關HCC的發病機制仍尚未完全闡明，且多數患者確診時肝臟儲備功能降低，全身狀態惡化，失去手術治療機會[2]。因而，探索HCC早期病理特點對HCC治療具有重要意義。而HCC建模是開展HCC基礎研究的必然選擇，兔VX2肝癌模型被認為與人類HCC病理特征相近[3]，而超聲引導下經皮穿刺植瘤是目前臨床常用HCC動物建模方法，但近年來有學者對其建模成瘤率和臨床應用提出異議[4-5]。筆者對超聲引導下肝癌模型建立的方法進行改良，對比分析兩種建模方式的效果，報道如下。

材料與方法

1.實驗動物、設備及試劑

選擇40只清潔級新西蘭白兔作為實驗動物，另取1只荷瘤兔用于VX2肝癌腫瘤組織塊懸液備制。白兔均由貴州醫科大學動物中心提供，要求白兔體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限。戊巴比妥鈉粉劑購自中國醫藥集團，生產批號F20081216。戊巴比妥鈉采用0.9%生理鹽水配成3.0%溶液后使用。速眠新購自長沙拜特生物科技研究所有限公司，批準文號：獸藥字180121777。超聲診斷儀為Philips HD7型飛利浦彩色多普勒超聲診斷系統。數字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)采用日本東芝公司生產的INFFX 8000V型800毫安以上DSA造影機。

2.實驗步驟

觀察組實驗步驟 ：①VX2腫瘤組織塊懸液備制：對VX2荷瘤兔稱重，一側后腿肌注3%戊巴比妥鈉1 mL/kg，另一側肌注速眠新0.2 mL/kg。麻醉起效后，逐層剝離荷瘤兔后腿組織，暴露并切除腫瘤組織，洗凈后置于無菌培養皿內，縱行切開腫瘤組織，用無菌剪刀將腫瘤標本剪成0.5 mm3瘤粒，按1:1比例將瘤粒與無菌生理鹽水混勻，獲得腫瘤組織懸液備用。②肝癌模型建立：取20只實驗白兔，麻醉方法同VX2荷瘤兔，麻醉起效后，將白兔固定于實驗板上，鋪無菌巾，行肝臟超聲掃描。在超聲引導下，采用18G穿刺套管針在肝左葉內側段膈面與外側段臟面重疊處經皮進行肝臟穿刺，穿刺針穿入肝臟深度0.8～1.0 cm，在進針距體表1.5～2.0 cm，回吸無膽汁及血液后，退出針芯，留置穿刺鞘管，在超聲引導監視下，經穿刺鞘管將0.3 mL肝癌腫瘤組織懸液緩慢注入肝組織內。完成后將明膠海綿條裝于18G血管鞘前端，鞘管尾端接上頭端裝有凝膠海綿條的另一個穿刺鞘管，采用平頭穿刺針芯將明膠海綿條推入前一個鞘管，取下尾端鞘管及針芯，再用平頭針芯將明膠海綿條緩慢推入穿刺針道內(圖1)，壓迫止血30 s后放回動物箱內。③超聲監測：在建模術后每周行1次超聲檢查，檢查時選擇線陣探頭，頻率8.0～12.0 MHz，行彩色多普勒超聲檢查，記錄肝臟超聲回聲特點、腫瘤大小、形態。待腫瘤直徑生長至2.5 cm時行DSA檢查，全麻后將動物仰臥位固定，在右側股動脈搏動最明顯處做切口，暴露股動脈并結扎動脈遠端，透視下配合Progreat微導絲將微導管經腹腔干引至肝總動脈，注入碘海醇造影劑1 mL行DSA檢查，記錄造影結果。術后結扎股動脈近端，縫扎切口。

圖1 a) 超聲引導下將0.3 mL腫瘤組織懸液經穿刺鞘管緩慢推入肝臟內；b)采用18G穿刺套管針穿刺，明膠海綿條裝于18G血管鞘前段，明膠海綿進入穿刺針道后膨脹。 圖2 尸檢取出肝臟標本，見團塊狀瘤體，肝內種植成功。 圖3 尸檢取出肝臟標本，見肝周及網膜廣泛結節灶，為腫瘤異位種植。

對照組實驗步驟：對實驗白兔行后腿肌注戊巴比妥鈉2 mL/kg麻醉，麻醉起效后行超聲檢查，在超聲引導監視下將0.3 mL VX2腫瘤組織懸液緩慢注入肝組織內。完成后退針，局部壓迫止血30 s后放回動物箱內。建模術后每周行1次超聲監測。兩組均在建模術后正常喂養60 d，記錄白兔死亡時間，喂養滿60 d后處死白兔，并進行尸檢，取肝臟病灶組織進行病理檢測。

3.統計學分析

結 果

1.兩組建模手術情況比較

觀察組建模術中麻醉誘導時間較對照組顯著縮短，術中白兔蘇醒率顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組手術時間差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組建模術中情況比較

2.兩組腫瘤種植結果

觀察組白兔術中無死亡，對照組有2只死亡，均因術中麻醉蘇醒未及時處理死亡。觀察組術中死亡率低于對照組，但兩組間差異無統計學意義(Fisher檢驗，χ2=0.487，P=0.244)。超聲檢查并經尸檢結果證實，觀察組17只肝內種植成瘤，2只肝外腹壁浸潤，1只未發現瘤體，成瘤率為95%，異位種植率為10%，建模術后60 d內有1只建模成功白兔在術后第7周時死亡，存活19只，白兔建模術后60 d存活率為95%。對照組9只肝內種植成功，5只腹壁浸潤，3只腹膜腔種植，1只未發現瘤體，成瘤率為85%，異位種植率為40%，建模術后60 d內有2只肝癌建模成功白兔在術后第6周時死亡，存活16只，存活率為80%。兩組成瘤率差異無統計學意義(Fisher檢驗，χ2=0.605，P=0.302)，兩組白兔建模術后60 d存活率差異無統計學意義(χ2=2.057，P=0.151)，兩組異位種植率差異有統計學意義(χ2=4.800，P=0.028)。腫瘤種植結果見圖2、3。

3.兩組建模后超聲監測結果

排除建模失敗和建模術中死亡白兔，觀察組19只和對照組17只建模成功。對建模成功白兔進行超聲監測，結果顯示兩組術后2周、3周及4周時腫瘤病灶直徑均顯著大于術后1周，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組術后2周與術后3周的腫瘤直徑差異無統計學意義(P>0.05)。術后4周觀察組腫瘤直徑顯著大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。兩組腫瘤病灶被首次超聲檢查發現時均以等回聲表現為主，待病灶直徑生長至2.5 cm左右時行DSA造影多可見“抱球征”(表3，圖4)。在術后3周時可發現腫瘤壞死，病灶中心無回聲，彩色多普勒超聲檢查提示無血流信號。肝臟內可見結節呈稍高回聲、回聲均勻(圖5)。

圖4 肝癌病灶DSA血管造影，可見腫瘤病灶直徑約2.48cm，病灶動脈期異常染色、血供豐富，門靜脈期病灶染色減退，瘤體呈“抱球征”。 圖5 肝癌腫瘤超聲表現。a) 肝臟內可見結節呈稍高回聲、回聲均勻；b) 可見無回聲區。 圖6 低倍鏡下(×100)觀察肝癌腫瘤細胞。 圖7 高倍鏡下(×400)觀察肝癌腫瘤細胞。

表2 兩組成瘤白兔術后直徑比較 (cm)

表3 兩組成瘤白兔超聲及DSA造影表現特點 (n，%)

4.兩組腫瘤病理結果

白兔死亡后取肝臟病變組織進行病理檢查，病理結果顯示成瘤白兔病變區域與周圍正常組織邊界欠清晰，可見癌巢樣結構，腫瘤細胞排列紊亂,形態各異(圖6、7)。兩組共36只建模成功，腫瘤病理結果顯示病灶直徑為(3.92±0.41)cm，最后一次超聲檢查結果顯示腫瘤直徑為(3.93±0.38)cm;超聲與病理結果差異無統計學意義(t=0.068，P=0.946)，兩者具有良好的一致性(r=0.993，P=0.000)。

討 論

建立良好的肝癌動物模型是開展基礎實驗的必要條件，VX-2腫瘤細胞株是源于Shope病毒誘發的兔乳頭狀瘤鱗癌，經72次移植傳代后建立的瘤株。移植性VX-2白兔肝癌模型不僅具有與人類相近的組織分型和生物學行為，還可在肝臟、骨骼、腎臟及軟組織等臟器種植生長，且腫瘤血管生長速度快，血供豐富[6-7]，這也為影像學研究創造了條件。因而，白兔作為肝癌動物模型在臨床得到廣泛應用。

經皮行肝穿刺與開腹穿刺接種相比，手術創傷小，術中死亡率低，重復性好[8]，本研究結果也顯示兩組僅對照組發生2只白兔術中死亡，與既往報道一致。本研究利用組織細胞懸液注入瘤株，可通過細胞計數保證細胞數量和濃度的一致性。術中良好的麻醉方案有助于降低動物術中蘇醒率和實驗動物死亡風險，戊巴比妥鈉通過阻斷腦干網狀結構上行激活系統，抑制中樞神經[9-10]，發揮鎮靜和抗驚厥作用。本研究選用戊巴比妥鈉，以肌注方式進行，這種方式可減緩藥物吸收速率，有助于避免因一過性濃度過高導致白兔死亡[11]。但Kageyama等[12]認為單藥麻醉效果有限，既往報道也顯示單藥麻醉術中動物蘇醒率高，這成為建模術中重要的死亡原因[13]。本研究中對照組2只白兔均因麻醉意外死亡，與上述報道一致。速眠新是由ED-TA、DHE-HCL及氟哌啶醇組成的復方麻醉制劑，具有誘導期短、麻醉起效快等特點[14]。本研究在觀察組中采用戊巴比妥鈉與速眠新復合麻醉，兩者可發揮協同作用，以縮短麻醉誘導時間，提高麻醉效果。本研究結果顯示觀察組麻醉誘導時間較對照組顯著縮短，且術中蘇醒率顯著降低，說明復合麻醉較單一麻醉更有助于保證建模術的安全性。

本研究對建模術進行改良，在注入懸液后封堵穿刺道。本研究根據明膠海綿遇水膨脹原理[15]，將明膠海綿碾壓呈條狀，讓前一個含有組織懸液的鞘管與另一個含明膠海綿條的鞘管頭端完成對接，這可使明膠海綿進入穿刺針道后膨脹，從而防止腫瘤組織懸液外滲至肝周或腹腔，降低術后血腫和異位種植風險。另外，手術操作也與異位種植相關。兔肝體積左葉大于右葉，本研究選擇肝左葉內側段膈面與外側段臟面重疊處作為穿刺點進行種植，肝左葉外側段客觀上起到阻隔作用，有助于防止腹壁和腹腔異位種植。此外，進針角度也影響腫瘤懸液細胞定植。進針角度應適宜，避免角度太大和進針太深，從而有效防止懸液沿針道逆行反流或穿透肝臟[16]，引起腹腔內廣泛種植。因而，本研究推薦進針時穿刺針穿入肝臟深度以0.8～1.0 cm為宜。本研究結果顯示觀察組異位種植率顯著低于對照組，與上述結論一致。

本研究結果顯示兩組白兔腫瘤均在術后2～3周時迅速生長，直徑達到2～3 cm，與既往報道一致[17]。此時行超聲和DSA檢查既可避免病灶過小而顯示不清，也可防止病灶過大而導致全身轉移。超聲和DSA檢查可為肝臟介入治療提供依據，已在臨床廣泛應用[18]。本研究結果顯示超聲與病理結果一致性較好，這提示超聲可作為VX-2白兔肝癌模型的監測工具。本研究結果還顯示對于首次發現與腫瘤壞死等不同階段白兔肝癌模型的超聲結果存在顯著差異，提示超聲檢查可動態觀察腫瘤生長情況，為判斷腫瘤病理進程提供參考。另外，腫瘤生長至2～3cm時血管造影也可清晰顯示“抱球征”，這不僅可為進一步明確肝癌腫瘤組織血供情況提供依據，還有助于下一步病理檢查的開展。

綜上所述，復合麻醉與針道封堵用于超聲引導下肝癌建模術能顯著提高手術安全性，彩色多普勒超聲可作為動態監測建模術后腫瘤生長的影像學檢查工具。