白細胞介素-33對巨噬細胞極化的影響

楊笑瑞，李婭，程曉寒，朱琳，司彤彤，徐峰

(鄭州大學第一附屬醫院 消化內科，河南 鄭州 450052)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以黏膜和黏膜下炎癥為特征的特發性慢性腸病，由于病情惡化和緩解的交替出現,其臨床病程不可預測[1-2]。一般認為，遺傳、微生物和環境因素相互作用最終導致免疫和非免疫反應，持續激活腸道黏膜，導致炎癥發生[3-5]。既往研究一致認為，巨噬細胞極分化在UC的發展中起著重要作用。M1極化表型巨噬細胞為促炎細胞，而M2巨噬細胞為抗炎細胞，巨噬細胞的M2型極化被認為是緩解各種炎癥反應的有效方法之一[6]。白細胞介素-33(interleukin-33，IL-33)是近年來新發現的IL-1家族分子，是適應性和先天免疫的關鍵調節劑，ST2是其特異性的受體，IL-33通過作用于ST2來誘導Th2型免疫反應[7]。有研究表明，IL-33在小鼠腸炎模型中表達水平升高，其在UC中的作用可能與調節巨噬細胞極化相關[8]。本研究進行體外實驗，檢測IL-33對巨噬細胞表面特異性標志物表達的影響，初步探討其對巨噬細胞極化的影響，為今后研究IL-33在UC中的作用機制及尋求潛在作用靶點提供理論依據和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器C57BL/6J雄性SPF級小鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0009]，8～10周齡，質量21～30 g。IL-33、Anti-CD206、Anti-CD86、Anti-F4/80熒光抗體購于上海康朗生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀購于上海英拜生物科技有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1體外誘導M0型巨噬細胞 將C57BL/6J雄性SPF級小鼠脫頸處死后置于體積分數為75%的乙醇中浸泡消毒。去皮剔肉后暴露股骨及脛骨，切除關節面，暴露骨髓腔，獲取小鼠骨髓來源單核細胞。后以巨噬細胞分化培養基[DMEM+體積分數為10%的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+ 50 μg·L-1巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)+體積分數為1%的雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)]培養7 d。光鏡下觀察細胞形態的變化，以F4/80抗體鑒定巨噬細胞誘導成功的比率。

1.2.2分組培養 將上述誘導成功的M0型巨噬細胞根據孔序列隨機分為IL-33組和對照組。對照組置于普通培養基[DMEM、體積分數為10%的FBS、體積分數為1%的雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)]中，IL-33組置于含IL-33培養基[DMEM、體積分數為10%的FBS、10 μg·L-1的IL-33、體積分數為1%的雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)]中，孵育24 h。

1.2.3檢測兩組巨噬細胞M1/M2型表型及相關基因分子的表達 每組均以相同來源的未標記單抗作為陰性對照，通過流式細胞術檢測CD86(M1型巨噬細胞表型)、CD206(M2型巨噬細胞表型)的陽性比率；通過qRT-PCR法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)表達(TNF-α、Arg-1分別為M1、M2型特征性分子標志物)。Arg-1上游引物序列為5’-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3’，下游引物序列為5’-TCTACGTCTCGC AAGCCAATGTAC-3’；TNF- α的上游引物序列為5’-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3’，下游引物序列為5’-TCTACGTCTCGCAAGCCAATGTAC-3’。引物序列從Primerbank查找得到。

2 結果

2.1 M0型巨噬細胞分化成功經GM-CSF刺激后，細胞形成巨噬細胞集落。第4天時，細胞不規則，有集落生成，但不多。至第6天時，已有明顯的巨噬細胞集落形成，且細胞呈圓形或橢圓形，基本無偽足。與M0型巨噬細胞形態比較接近。為進一步確認，進行F4/80(M0型表型)流式鑒定。流式檢測結果表明，F4/80陽性細胞率為95.3%，說明巨噬細胞M0型分化成功，見圖1。

2.2 IL-33在體外可調節巨噬細胞的極化流式細胞術檢測到IL-33組巨噬細胞的CD206的陽性率高于對照組，且CD86的陽性率低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。qRT-PCR檢測各組巨噬細胞TNF-α及Arg-1的mRNA表達量，見圖3。IL-33體外刺激24 h后，TNF-α的表達較對照組減少，而Arg-1的表達較對照組增加，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 M0型的流式鑒定

圖2 M1/M2表型的流式分析

與對照組相比，**P<0.05。

3 討論

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞在刺激下產生的具有生物活性的一類多肽或糖蛋白，是炎癥效應細胞之間信息傳遞的中介，通過結合相應受體來調控免疫應答。目前的研究顯示細胞因子在UC的發病中起著雙重作用，包括促炎與抗炎作用[9]。其中發揮抗炎作用的細胞因子主要包括IL-4、IL-10、IL-13等，發揮促炎作用的細胞因子主要有IL-1、IL-6、IL-12、干擾素等，其中IL-1在多種細胞中均有表達，也是研究最多的一種細胞因子。巨噬細胞是協調宿主先天和適應性免疫反應的關鍵的固有免疫細胞，作為免疫系統的控制開關，在細胞因子的調節下，通過不同的激活水平和極化狀態來維持免疫穩態[10]。巨噬細胞具有很強的異質性和可塑性，在不同的微環境中可以極化為兩種不同的細胞亞群，包括經典活化型(M1型)和替代活化型(M2型)。其中M1型極化主要由脂多糖或干擾素-γ誘導，其高表達IL-12，低表達IL-10和IL-4，在Th1型免疫應答中發揮重要作用，巨噬細胞的M1型過度極化會導致免疫損傷；M2型極化主要由IL-4或TGF-β等細胞因子誘導，M2型巨噬細胞高表達IL-10，低表達IL-12，主要參與Th2型免疫反應，同時可抑制Th1型免疫反應，在免疫應答中具有抑制炎癥反應的功能[11]。由此可見，巨噬細胞在細胞因子的調節下進行M1/M2型極化，其極化的不同會導致細胞因子的失調，反之又加劇了巨噬細胞的極化失衡，循環往復，這被認為是UC發病的分子學基礎之一[12]。

IL-33是2003年在高內皮細胞小靜脈中發現的新型IL-1家族細胞因子，通過與其受體ST2結合發揮生物學效應，在調節性免疫反應中發揮作用[13]。IL-33被認為是一種同時具有促炎和抗炎雙重功能的細胞因子[14]。已有研究證實IL-33在UC患者及UC小鼠模型中存在異常表達[15]，但關于IL-33在UC中的作用究竟是致病性還是保護性仍未得到充分闡明，其在UC中的具體作用機制仍在探索之中。因此，本研究通過體外細胞實驗檢測IL-33對巨噬細胞相關分子標志物表達的影響，初步探討其在UC炎癥反應中的免疫調控作用。實驗結果表明IL-33可增加CD206+細胞比率及Arg-1的表達，并降低CD86+細胞比率及TNF-α的表達，提示IL-33在體外不僅能夠誘導M2型巨噬細胞極化，還能抑制M1型巨噬細胞活化，這一結果與Zhu等[16]的研究結果相吻合。M2型巨噬細胞主要參與Th2型免疫反應，同時可以抑制Th1型免疫反應，在免疫反應中可起到抑制炎癥反應的作用。由此可見，IL-33可通過誘導巨噬細胞向抗炎的M2型方向極化來下調促炎因子，抑制炎癥反應，產生細胞外基質，促進上皮細胞損傷修復和黏膜愈合。推測IL-33可能通過促進巨噬細胞的M2極化來改善腸道炎癥，以此緩解UC。其有望成為新的治療靶點，針對巨噬細胞極化對UC進行疾病干預，但仍需進一步研究證實。

綜上所述，本研究發現IL-33在體外可促進巨噬細胞的M2型極化，推測可能與其緩解UC有一定的相關性，有望成為一種新的UC預后生物標志物及治療靶點。有必要進行更深入的研究，探討其在UC的不同發病階段和不同免疫狀態下的作用以及M2型巨噬細胞在UC中的具體調控機制，為UC的治療提供新的方向。