三黃瀉心湯三味藥聯合抗生素對幽門螺桿菌的體外抑菌實驗研究

耿 聰，李 巖,姚鑫潔

0 引言

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染與慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌、胃Malt淋巴瘤等疾病的發生發展密切相關[1-4]，故Hp的根除有重要的臨床意義。近年來，Hp的根除率逐年下降，這主要與其對相關抗生素的耐藥有關[4-6]，耐藥率最高的3種抗生素為克拉霉素(Clarithromycin,CLR)、左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)、甲硝唑(Metronidazole,MTZ)[7-8]。近年來，中西藥聯合應用使Hp根除率有所提高[6]。一些研究已證實，三黃瀉心湯組方及其組成大黃、黃連、黃芩及三味中藥的有效成分：黃連(小檗堿/黃連素、黃連堿、巴馬汀)、大黃(大黃酸、大黃素)、黃芩(黃芩苷、黃芩素)有體外抑殺Hp的作用[9-13]，但有關三味中藥之間及三味中藥與抗生素聯合應用的抑菌效果是否存在抗菌增敏的研究尚未見報道。本項研究對組成三黃瀉心湯的大黃、黃連、黃芩進行體外抑菌實驗，探討三味中藥之間的聯合抑菌效果及三味中藥與CLR、LEV、MTZ的聯合抑菌效果，為臨床應用三黃瀉心湯及三味中藥在根除Hp治療中的方案制定提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 Hp菌株ATCC43504(中國疾病預防控制中心贈予)。ATCC43504菌株為美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)細菌藥敏實驗執行指南推薦的質控菌株。菌株為CLR、LEV的敏感菌株，為MTZ的耐藥菌株。

1.1.2 主要藥物及試劑 中藥生藥黃連、大黃、黃芩(沈陽市中醫院)，克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑標準品(美侖，批號：MB1058-S、MB1076-S、MB2200-S)，Karmali固體培養基試劑(OXOID，貨號:CM0935)，幽門螺桿菌選擇性添加劑(OXOID，貨號:SR0147E)，PBS緩沖液(美侖，批號：MA0015)，DMSO(索萊寶，批號：D8370-100)，冰醋酸(大茂化學試劑廠)。

1.1.3 主要設備 真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SCIENTZ-12N)，超凈工作臺(青島海爾公司，型號：HR40-IIA2)，恒溫培養箱(上海精宏設備公司，型號:DNP-9162)，電熱恒溫水浴鍋(上海森信儀器公司，型號:DK-S24)。

1.2 方法

1.2.1 實驗藥液的制備 中藥：大黃、黃連、黃芩分別置于砂鍋中，8倍量(按質量算)冷水浸泡1 h，武火煮沸后文火煎30 min，濾出藥液留存，所剩藥渣再加適量冷水重復以上煎煮及濾出過程，合并兩次濾液。所有濾液經真空冷凍干燥機處理后形成粉劑，用雙蒸水按生藥質量計算配成濃度為1 g/ml的藥液，作為實驗藥液的母液，密封冷藏保存。

抗生素：根據CLSI細菌藥敏實驗執行指南，分別應用DMSO溶解MTZ、冰醋酸溶解CLR及LEV，并分別用PBS緩沖液對CLR、雙蒸水對MTZ及LEV加以稀釋，參照CLSI指南規定的Hp菌株ATCC43504對抗生素的質控范圍(表1)，將MTZ、LEV、CLR標準品配成濃度為MTZ 5 120 mg/L、LEV 5 mg/L、CLR 5 mg/L的溶液(藥液濃度至少為質控范圍高值的10倍)，以此作為實驗藥液的母液，密封冷藏保存。

采用二倍稀釋法將實驗藥液母液稀釋成如下的濃度：參照文獻[9]將大黃、黃連、黃芩用雙蒸水分別稀釋成1∶10(100 mg/ml)、1∶20(50 mg/ml)、1∶40(25 mg/ml)、1∶80(12.5 mg/ml)、1∶160(6.25 mg/ml)、1∶320(3.12 mg/ml)、1∶640(1.56 mg/ml)7種不同濃度的藥液；參照ATCC43504對抗生素的質控范圍，將抗生素制成如下濃度藥液：CLR：2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08 mg/L；LEV：5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08 mg/L；MTZ：5 120、2 560、1 280、640、320 mg/L。將以上6種藥物的共計39種濃度的藥液密封冷藏保存，備用于后續單藥藥敏實驗及聯合藥敏實驗中含藥培養基的制備。

1.2.2 Hp培養基的制備 普通培養基：Karmali固體培養基試劑21.5 g+雙蒸水475 ml，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度降至50 ℃左右，加入脫纖維羊血25 ml、Hp選擇性添加劑1瓶，混合均勻后吸取20 ml加入無菌平皿，待瓊脂冷卻，將培養皿倒置，冷藏保存。

含藥培養基：Karmali固體培養基試劑21.5 g+雙蒸水425 ml，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度降至50 ℃左右，加入脫纖維羊血25 ml、Hp選擇性添加劑1瓶，混合均勻后吸取18 ml加入無菌平皿，另加入不同成分、不同濃度的實驗藥液2 ml，混勻，待凝固后倒置冷藏保存。

1.2.3 Hp培養、鑒定、傳代 將保存的Hp菌株ATCC43504接種到普通培養基，將培養皿倒置，于37 ℃、微需氧環境培養3 d，經尿素酶試驗、過氧化物酶試驗鑒定證實為Hp。菌株傳代擴增菌量，備用于后續藥敏實驗。Hp菌液的制備：Hp菌株于上述條件下培養3 d，用無菌接種環刮取適量菌落，置于生理鹽水中，用移液器吹打均勻，制成麥氏濁度為2的菌液，立即用于藥敏實驗。

1.2.4 藥敏實驗 單藥藥敏實驗。(1)藥敏紙片法。①制作中藥藥敏紙片：直徑6 mm的空白藥敏紙片分別滴入25 μl的1 g/ml的大黃、黃連、黃芩藥液，空白藥敏紙片滴加25 μl無菌雙蒸水做對照，放置于超凈工作臺中待紙片干燥。②接種Hp：90 μl麥氏濁度為2的菌液滴入上述普通培養基，棉簽均勻涂開。③置入藥敏紙片、觀察抑菌環：使用無菌鑷子將不同藥敏紙片分別放置于接種Hp后的普通培養基表面的中心位置，培養3 d，后觀察有無抑菌環形成，并測量抑菌環直徑。抑菌環大小反映中藥大黃、黃連、黃芩對Hp的抑制能力。(2)瓊脂稀釋法：90 μl麥氏濁度為2的菌液分別滴入上述含藥培養基中，用棉簽將菌液均勻涂開。另用實驗菌株(質控菌株)設對照組：90 μl麥氏濁度為2的菌液滴入普通培養基。培養3 d后，觀察Hp生長狀況，記錄能完全抑制Hp生長的培養基中藥物的最低濃度，即最小抑菌濃度(MIC)。

聯合藥敏實驗。采用瓊脂棋盤稀釋法，設計中藥大黃、黃連、黃芩不同組合及中藥大黃、黃連、黃芩分別與抗生素CLR、LEV、MTZ聯合，共12種聯合方案的藥敏實驗。

聯合藥敏實驗所用培養基的制備：根據單藥藥敏實驗得到的藥物的MIC，分別制備5種濃度的實驗藥液備用，使最終含藥培養皿中藥物的濃度為2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。Karmali固體培養基試劑21.5 g+雙蒸水425 ml，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度降至50 ℃左右，加入脫纖維羊血25 ml、Hp選擇性添加劑1瓶，混合均勻后吸取18 ml加入無菌平皿，另加2種上述實驗藥物的藥液各1 ml并混勻。待凝固后倒置冷藏保存。每種聯合方案共計制備25種培養基用于聯合藥敏實驗。

聯合藥敏實驗：90 μl麥氏濁度為2的菌液分別滴入含有聯合實驗藥物的培養基上，用棉簽將菌液均勻涂開。另設對照組：90 μl麥氏濁度為2的菌液滴入普通培養基。培養3 d后，觀察每種聯合方案的培養基中Hp生長狀況，記錄兩種藥物聯合時各自的MIC并計算聯合抑菌指數(Fractional inhibitory concentration index,FICI)。FICI=聯合用藥時甲藥MIC/單獨用藥時甲藥MIC+ 聯合用藥時乙藥MIC/單獨用藥時乙藥MIC。FICI≤0.5時甲乙兩藥為協同作用；0.52時兩藥為拮抗作用。

2 結果

2.1 三味中藥對ATCC43504菌株的抑菌能力 藥敏紙片法抑菌環直徑及抑菌能力：黃連(22 mm)>大黃(18 mm)>黃芩(10 mm)，對照組培養皿中布滿Hp，未見雜菌及抑菌環。瓊脂稀釋法MIC及抑菌能力：黃連(0.625 mg/ml)>大黃(1.25 mg/ml)>黃芩(5 mg/ml)，對照組培養皿中布滿Hp，未見雜菌。

2.2 瓊脂稀釋法檢測抗生素對ATCC菌株的MIC 見表1。

表1 ATCC43504菌株的質控范圍、耐藥折點及MIC(mg/L)

2.3 聯合藥敏實驗檢測各中藥間、中藥與抗生素聯合的抑菌效果 聯合用藥時，大黃、黃連、黃芩及抗生素CLR、LEV、MTZ的MIC皆較單用時下降(表2，表3)。

三黃瀉心湯的組成大黃、黃連、黃芩兩兩聯合用藥，有相加作用或協同作用，未見拮抗作用。黃連與黃芩聯合，藥物敏感性提升較大，藥物聯合有協同作用(表2)。

大黃、黃連、黃芩分別與抗生素CLR、LEV、MTZ聯合用藥，有相加作用或協同作用，未見拮抗作用。黃連與CLR、黃連與MTZ、黃芩與MTZ聯合，實驗藥物敏感性提升較大，藥物聯合有協同作用。菌株ATCC43504為抗生素MTZ的耐藥菌株，抗生素MTZ與黃連、黃芩聯合用藥時，敏感性提升較大，但聯合用藥時抗生素MTZ的MIC大于耐藥折點8 mg/L，菌株依然對抗生素MTZ耐藥(表3)。

表2 三味中藥間聯合用藥的MIC及聯合抑菌效果

3 討論

隨著對Hp根除的普及，Hp對抗生素(尤其是CLR、MTZ及喹諾酮類)的耐藥率在世界范圍逐年升高[14]。體外或動物體內實驗研究表明，某些中藥、中藥提取物以及含中藥的黏膜保護劑有抑制Hp的作用[9,15-17]，全國多中心隨機平行對照的臨床研究顯示，三聯或四聯療法聯合中藥可以提高Hp根除率，減少三聯或四聯療法藥物不良反應，對Hp根除失敗的患者亦能取得較好的療效[6,18-21]。有研究表明，中藥提取物威迫耐藥Hp菌株能提高其對抗生素的敏感性，甚至逆轉耐藥性使其變為敏感菌株[22]。因此，將傳統中藥或者中藥組方與抗生素聯合應用于根除Hp在提升抗生素對菌株敏感度、減輕抗生素帶來的不良反應方向的研究成為新的熱點。

表3 中藥與抗生素聯合用藥的MIC及聯合抑菌效果

有研究對臨床根除Hp的核心中藥進行歸經分析，得出結果：治療Hp的中藥歸脾胃二經，以清熱解毒、健脾益氣為主，清熱解毒藥類黃連使用較多，健脾益氣多使用黃芪[23]。三黃瀉心湯出自張仲景的《金匱要略》，由大黃、黃連、黃芩3種中藥組成，主要功效為瀉火解毒，燥濕泄熱除痞。近年體外研究已證實其有抑殺Hp的作用[13]。現代藥理研究證明，三味中藥有抗炎、體外殺滅Hp作用[24-26]，但關于三味中藥間聯合對Hp抑制是否存在增敏作用未見報道。本課題組前期在三黃瀉心湯組方及其組成成分大黃、黃連、黃芩抑制Hp的臨床研究中，證明了三黃瀉心湯及其中的三味中藥與抗生素聯合用于臨床，能提高Hp根除率、改善胃不適癥狀、減輕根除Hp過程中抗生素引起的不良反應[27-28]，但有關三味中藥與抗生素聯合應用的抑菌效果及是否存在抗菌增敏的體外實驗研究尚未見報道。

本實驗選用CLSI推薦的ATCC43504質控菌株進行藥敏試驗，實驗過程中抗生素的MIC皆在允許質控范圍內，保證了結果的可靠性。通過藥敏紙片法及瓊脂稀釋法皆證實大黃、黃連、黃芩三味中藥有抑制Hp作用，抑菌能力從強到弱依次為黃連、大黃、黃芩，在此基礎上，采用瓊脂稀釋棋盤法判斷聯合抑菌效果。瓊脂稀釋棋盤法較肉湯稀釋棋盤法工作量大、過程繁瑣、耗材多[29]，但對于中藥的藥敏實驗不僅能避免中藥藥液顏色對結果的干擾，而且可以更直觀地判斷藥敏結果。聯合用藥時，大黃、黃連、黃芩及抗生素CLR、LEV、MTZ的MIC皆較單用時下降。黃連與黃芩、黃連與CLR、黃連與MTZ、黃芩與MTZ聯合有協同作用，即兩藥的聯合作用大于單獨作用的總和。其余藥物組合均為相加作用，即兩藥的聯合作用等于單獨作用的總和。Hp菌株ATCC43504為抗生素CLR、LEV的敏感菌株，為抗生素MTZ的耐藥菌株，結果表明，中藥對菌株ATCC43504有抑制作用，聯合用藥時，菌株對CLR、LEV、MTZ的敏感性皆有所提升。因此，中藥與抗生素CLR、LEV、MTZ聯合，可以一定程度上提高抗生素的敏感性；中藥聯合較單藥有更強的抑制Hp能力，而三黃瀉心湯組方對Hp的抑制作用可能遠遠大于三味中藥分別單用。

綜上所述，三黃瀉心湯的組成大黃、黃連、黃芩對Hp有抑制作用，三味中藥的聯合應用較單藥對Hp有更強的抑制作用，中藥與抗生素的聯合可以進一步提高抗生素抑制Hp的作用。本研究為臨床上中藥三黃瀉心湯輔助抗生素提高Hp的根除率提供了一定的理論依據，為中藥輔助根除Hp的研究提供了新的實驗數據。