負載蝦青素的油凝膠納米乳液的構建及體外消化研究

夏天航,魏子淏,馬磊,奚曉鴻,宋琳,徐雅男,薛長湖

(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266003)

油凝膠是一種將油包裹在三維網狀結構中且熱可逆的凝膠體系,它可以抑制液態油的流動,從而具有一定的功能結構特性[1-2]。食品級油凝膠因其優良的可塑性、質地、感官特性和物理穩定性等性能在食品行業得到廣泛應用[3-4]。由于動物脂肪的供應相對較少并且其中的飽和脂肪含量較高,近年來通常通過植物油的氫化來提高油的可塑性,這會導致對人體有害的反式脂肪酸的產生[3-5]。研究表明,開發具有良好可塑性的油凝膠是替代飽和脂肪和反式脂肪的有效途徑。油凝膠不僅能提高油脂的可塑性和機械性能,還能作為營養物質的輸送系統[6]。油凝膠的三維網狀結構提供的物理屏障能夠延緩營養物的釋放,從而達到對這些營養物的控釋[7]。

納米乳液是指一種液相以納米液滴的形式分散于另一種與之不相溶的液相中,一般由水、油和表面活性劑(或蛋白質、多糖等兩親性生物大分子)組成[8-9]。納米乳液也是一種有效的輸送體系,該體系具有安全性高、制備簡單等優點,并且可以提高親脂類化合物的溶解度和生物利用率[10-11]。但傳統的由表面活性劑穩定的納米乳液因安全性問題難以用于食品體系,因此需要使用食品級兩親性生物大分子作為乳化劑,以增加其在食品行業中的應用。

盡管油凝膠有很多優點,但是其較差的水分散性極大地限制了應用。研究表明,油凝膠納米乳液可以顯著提升水分散性,拓展油凝膠基遞送系統的應用前景。然而,當前制備的油凝膠納米乳液多由表面活性劑穩定,很少有團隊利用食品級兩親性生物大分子(如蛋白質)作為乳化劑制備油凝膠納米乳液?？紤]到表面活性劑大多具有潛在生物毒性,有必要開發由蛋白質穩定的油凝膠納米乳液。

蝦青素是一種脂溶性類胡蘿卜素,且蝦青素具有多種保健功效,如降血糖、降血脂、提高機體免疫力、抗癌等[12-13]。但是蝦青素的理化性質極不穩定,容易氧化、見光易分解,因此很難保留其活性[14]。而且本課題組的前期研究表明,蝦青素的生物可利用率較低[12]。因此,通過將蝦青素包埋于油凝膠中,創新性地采用2種蛋白作為乳化劑,制備荷載蝦青素的油凝膠納米乳液。通過體外模擬消化來探究蝦青素在油凝膠和油凝膠納米乳液中的生物可利用率,從而為開發以蝦青素作為功能物質的新產品提供理論依據,促進蝦青素的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

玉米油,廣東美味鮮調味食品有限公司；小燭樹蠟,上海阿拉丁生化科技有限公司；雞蛋清白蛋白,上海瑞永生物科技有限公司；乳清分離蛋白,美國Hilmar公司；胃蛋白酶(豬胃粘膜),上海源葉生物科技有限公司；胰酶(來源于豬胃粘膜),上海索萊寶生物科技有限公司；甲基叔丁基醚、甲醇、正己烷、丙酮、NaCl,國藥集團化學試劑有限公司；豬膽鹽,Sigma公司。

1.1.2 儀器設備

ZNCL-G190×90油浴鍋,鞏義市英峪高科儀器廠；TGL-20M臺式高速冷凍離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機,南京舜瑪儀器設備有限公司；Zetasizer nano zs90納米粒度電位儀,英國馬爾文儀器公司；TMS-TOUCH質構儀,美國FTC公司；Rhemeter MCR301流變儀,奧地利安東帕公司；漩渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小燭樹蠟臨界成膠濃度探究

采用SHAIKH等[15]的方法來探索小燭樹蠟的臨界最低添加量。稱取一定質量的玉米油,向其中加入小燭樹蠟(質量分數分別為1.0%、1.1%、1.2%、1.5%和2.0%),將其置于油浴鍋中80 ℃攪拌加熱至完全溶解。待冷卻至室溫后,將制得的樣品在4 ℃下儲存24 h以形成油凝膠備用。將制得的油凝膠在室溫下倒置,通過觀察樣品的流動性來判斷是否形成油凝膠,流動的為非凝膠態,不流動的為凝膠態。

1.2.2 小燭樹蠟添加量對凝膠相變溫度的影響

取小燭樹蠟質量分數分別為1.2%和2.0%的油凝膠樣品,在油浴鍋中緩慢升溫加熱,待樣品發生流動現象時,記錄此時的溫度,即為凝膠相變溫度。

1.2.3 小燭樹蠟添加量對油凝膠質構的影響

取小燭樹蠟質量分數分別為1.2%和2.0%的油凝膠樣品,在室溫條件下用質構儀測定油凝膠的硬度和彈性。測試過程采用TPA模式,探針以30 mm/min的速度壓入樣品中,每個樣品重復測試3次后取平均值。

1.2.4 流變學行為測定

應變掃描：在流變學測試之前,先通過應變掃描來定義小燭樹蠟油凝膠的線性黏彈區域。測試條件：剪切頻率恒定為f=1 Hz,采用PP50探頭,間隙設置為1 mm,測試溫度為室溫。取適量的油凝膠樣品放置在樣品臺上,穩定5 min后開始測定,獲得剪切應變在0.001%～10%對應的黏彈性變化譜圖。

頻率掃描：在線性黏彈區內的恒定低應變水平下(0.1%),頻率范圍0.5～20 Hz,對樣品進行頻率掃描測試,得到隨頻率變化的存儲模量(G′)和剪切模量(G″)。

1.2.5 荷載蝦青素的油凝膠納米乳液的制備

蛋白溶液制備：將一定質量的乳清分離蛋白和雞蛋清白蛋白分別溶于超純水中,使其質量濃度為50 mg/mL,用稀鹽酸調pH至3.0。

荷載蝦青素的油凝膠納米乳液制備：將玉米油和小燭樹蠟(質量分數為2.0%)置于80 ℃油浴鍋中加熱至融化,之后加入一定量的蝦青素(1 g油凝膠中加入1 mg蝦青素),加熱至蝦青素完全溶解。同時將蛋白溶液加熱至80 ℃。之后將小燭樹蠟/玉米油體系趁熱倒入熱的蛋白溶液中(體積比1∶9),將混合物置于超聲波細胞破碎儀中,采用Φ6變幅桿,功率630 W,超聲乳化處理5 min,得到油凝膠納米乳液。

1.2.6 納米乳液粒徑、ζ-電位測定

乳液粒徑和ζ-電位由馬爾文納米粒度電位儀測定。測量之前先用pH 3的超純水將乳液稀釋100倍,再分別倒入粒徑池和電位池中進行測量。每個樣品3次重復,取平均值。

1.2.7 荷載蝦青素油凝膠納米乳液的制備及體外模擬消化

模擬消化部分參考文獻[16-18]的方法并加以改進。

模擬胃消化：向1 L超純水中加入2 g NaCl,用稀鹽酸調節pH至1.2,制備模擬胃液。將含2 g玉米油的樣品(小燭樹蠟油凝膠和荷載蝦青素的油凝膠納米乳液)與16 mL胃液充分混合,在37 ℃恒溫油浴鍋中攪拌加熱。將新鮮溶解的4 mL胃蛋白酶倒入模擬胃液中開始胃消化,使最終的胃蛋白酶的質量濃度為1.6 mg/mL。在胃液中消化2 h后,調節pH至7.5滅活胃蛋白酶,胃消化終止。

模擬腸消化：將10 mmol/L CaCl2和10 mg/mL豬膽鹽溶于Tris-maleate緩沖液中,調節pH至7.5,得到模擬腸液。將胰酶添加至模擬腸液中,使胰酶的質量濃度為3.2 mg/mL。將胃消化后的樣品與等體積的模擬腸液混合以開始腸消化,保持37 ℃油浴120 min。在腸消化過程中,手動添加0.25 mol/L NaOH以維持混合液的pH為7.5,并記錄在整個腸消化過程中隨時間添加的NaOH的量。消化后以11 000 r/min離心45 min,離心后樣品分為上層油相、中間澄清的膠束相、底部不溶沉淀。收集中間的膠束相,并測定其中蝦青素的含量。

通過觀察游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的釋放來研究玉米油的消化情況。1 mol的玉米油可釋放2 mol的FFA,然后消耗2 mol NaOH,因此釋放的FFA比例按公式(1)計算：

(1)

式中:CNaOH,NaOH的濃度,mol/L；VNaOH,中和游離FFA的NaOH的體積,L；M玉米油,玉米油的分子質量,g/mol；mNaOH,最初的玉米油質量,g。

蝦青素提?。簠⒖荚氐萚19]的方法并加以改進。取5 mL收集的中間膠束相,加入[V(正己烷)∶V(丙酮進行)=1∶1]混合液振蕩30 s,4 000 r/min離心5 min,收集上層液體,下層溶液重復以上操作,直到上層液體無色,將所有的上清液合并。將收集到的上清液用氮氣吹掃至有機溶劑完全揮發,然后再用1mL [V(甲醇)∶V(甲基叔丁基醚)=1∶1]溶液溶解,之后用0.45 μm濾膜過濾,利用高效液相色譜法定量分析其中的蝦青素。蝦青素的生物可利用率按公式(2)計算：

(2)

高效液相色譜條件：色譜柱：YMC-C30(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相A：甲醇；流動相B：甲基叔丁基醚；梯度洗脫程序：0～10 min,10% B；10～30 min,60% B；30～40 min,10% B。流速1 mL/min；檢測波長476 nm；進樣量30 μL。

2 結果與分析

2.1 小燭樹蠟的最低添加量

玉米油富含不飽和脂肪酸和維生素E等營養素,我國年消費量已超過120萬t,因而玉米油被用來制備油凝膠。本研究首先研究油凝膠,是為了摸清以小燭樹蠟和玉米油為材料制得的油凝膠的性質,以提高以其為基底制備的納米乳液的性質。將油凝膠樣品倒置以確定油凝膠形成時的最低小燭樹蠟添加量。由圖1可知,小燭樹蠟質量分數為1.0%和1.1%時,油凝膠呈現流動狀態；當小燭樹蠟的質量分數≥1.2%時,無流動現象,可認為小燭樹蠟與玉米油形成油凝膠的小燭樹蠟最低添加量為1.2%。根據以前的研究,形成油凝膠所需的凝膠劑最低添加量越低,凝膠劑的凝膠能力越強。大多數凝膠劑的最低添加量為2.0%[20],因而小燭樹蠟是一種凝膠能力較強的凝膠劑。油凝膠的性質通常與凝膠劑的添加量有關,進而會影響油凝膠基膠體體系的性質。為確定制備油凝膠納米乳液中油凝膠基底的最適凝膠劑濃度,后續油凝膠的表征實驗均采用2個具有代表性的凝膠劑質量分數,即1.2%和2.0%。

從左至右油凝膠中小燭樹蠟質量分數分別為:1.0%、1.1%、1.2%、1.5%、2.0%圖1 小燭樹蠟含量對油凝膠外觀的影響Fig.1 Effect of the content of candelilla wax on the visual appearance of oleogels

2.2 小燭樹蠟質量分數對凝膠轉變點的影響

如圖2所示,小燭樹蠟質量分數為1.2%和2.0%的油凝膠凝膠轉變點分別為40和48 ℃,小燭樹蠟質量分數的提高對凝膠轉變點有明顯的影響,質量分數越高,凝膠轉變點越高。這可能與分子間氫鍵有關,小燭樹蠟的質量分數提高,其分子間的氫鍵也隨之增加,分子間作用力的增強使凝膠融化所需的熱量更高,因此凝膠轉變點的溫度也隨之提高[21]。

圖2 小燭樹蠟質量分數對油凝膠凝膠轉變點的影響Fig.2 Effect of the content of candelilla wax on gel-sol transition temperature of the oleogel

2.3 小燭樹蠟質量分數對油凝膠質構的影響

圖3顯示了小燭樹蠟的質量分數對油凝膠硬度和彈性的影響。通過TPA測定可以看出,小燭樹蠟添加量越大,得到的油凝膠的硬度和彈性越大。這是由于隨著小燭樹蠟的添加,三維網絡結構的數量和緊密度也隨之增加,從而增加了油凝膠的硬度與彈性。從增加的幅度來看,硬度的增加呈幾何倍數,而彈性的增大不到2倍,由此可知,小燭樹蠟質量分數的提高主要是對油凝膠的硬度產生影響。油凝膠的硬度越大,說明其凝膠結構更緊密。

圖3 小燭樹蠟質量分數對油凝膠質構特性的影響Fig.3 Effect of the content of candelilla wax on texture characteristics of oleogel

2.4 油凝膠流變特性分析

根據應變掃描的結果,確定了小燭樹蠟油凝膠的線性黏彈區,然后將應變固定為0.1%。從圖4可以看出,在掃描范圍內,油凝膠體系的G′均明顯大于G″。由于存儲模量G′和剪切模量G″代表體系的彈性和黏性部分,G′>G″表示樣品形成了凝膠結構。隨著小燭樹蠟質量分數的增加,G′大幅度增加,說明小燭樹蠟質量分數越大,油凝膠的凝膠網絡結構越緊密,這與質構分析的結果一致。

圖4 小燭樹蠟質量分數對油凝膠G′、G″的影響Fig.4 Effect of the content of candelilla wax on G′ and G″ of oleogels

根據以上幾種油凝膠的表征結果,小燭樹蠟質量分數為2.0%時，油凝膠無論是在凝膠相變溫度、質構、還是流變方面,其性質都優于小燭樹蠟質量分數為1.2%時。所以在后續納米乳液的制備過程中,采用小燭樹蠟質量分數2.0%的油凝膠,這對納米乳液的穩定性會產生有益的影響。

2.5 油凝膠納米乳液的構建、粒徑和ζ-電位

油凝膠的三維網絡結構會對乳液產生有益的影響,所以以油凝膠為基底油制備納米乳液。當乳液形成后,油凝膠的三維網絡結構能夠帶入乳液中,使乳液更穩定,難以發生破乳。因兩親性的食品蛋白質可高效地吸附在油水界面且有效地促進乳液的形成與穩定[22-24],本研究擬采用兩親性的食品蛋白質穩定油凝膠納米乳液。由于乳液的理化性質與乳化劑的類型密切相關,因此選取乳清分離蛋白和雞蛋清白蛋白來穩定油凝膠納米乳液,以探究不同乳化劑穩定油凝膠納米乳液的差異。

圖5展示了制備的負載蝦青素的油凝膠和2種油凝膠納米乳液樣品,荷載蝦青素的油凝膠呈深紅色,2種乳液呈淺黃色。2種油凝膠納米乳液均具有一定的流動性,且均是水包油乳液,可以在水中分散。雞蛋清白蛋白納米乳液容易起泡,超聲后有一部分會以泡沫形式存在,需靜置一段時間才會轉變成液態。

左-油凝膠;中-乳清分離蛋白納米乳液;右-雞蛋清白蛋白納米乳液圖5 負載蝦青素的油凝膠和兩種油凝膠納米乳液的外觀圖Fig.5 Visual appearance of oleogel and two types of oleogel-based nanoemulsions

如表1所示,在pH和蛋白濃度都相同的情況下,以乳清分離蛋白為乳化劑的納米乳液比雞蛋清白蛋白粒徑更小,小粒徑的納米乳液具有更強的穩定性。2種乳液的粒徑差異原因可能是2種蛋白的兩親性和界面特性不同[25-26],從而在乳液中達到不同的平衡狀態,因此影響了乳液的形成和穩定。ζ-電位對蛋白質穩定乳液的穩定性也有一定的影響。乳液的ζ-電位離蛋白質的等電點越遠,乳液就越穩定。因為ζ-電位越高,液滴間的靜電斥力越大,乳液具有更高的抗聚集和絮凝穩定性,同時液滴的大小也基本保持不變[27]。雞蛋清白蛋白的ζ-電位較低,因此液滴間的靜電斥力較小,液滴間容易互相吸引聚集,導致乳液粒徑增大,最終可能會發生破乳。

表1 蛋白乳化劑類型對油凝膠納米乳液粒徑和ζ-電位的影響Table 1 Effect of protein type on particle size and ζ-potential of oleogel-based nanoemulsion

2.6 油凝膠納米乳液的脂解

脂質在體外的模擬消化可通過分析脂質的分解來確定。由圖6可知,油凝膠中游離脂肪酸的釋放率低于2%,而游離脂肪酸在2種油凝膠納米乳液中的釋放比例均高于油凝膠,表明納米乳液中的脂肪分解程度更高,并且以乳清分離蛋白作為乳化劑的納米乳液，其游離脂肪酸釋放量高于以雞蛋清白蛋白穩定的乳液。影響納米乳液和油凝膠中脂質消化率可能有以下幾個因素:首先,納米乳液在模擬腸液中更容易分散,因此與蛋白酶的接觸面更大,而油凝膠在模擬腸液中的分散性很低,并且有大塊的油凝膠懸浮在消化液表面,這不利于油相和蛋白酶的充分接觸;其次,由于乳清分離蛋白納米乳液的粒徑較小,其界面面積比雞蛋清白蛋白納米乳液更大,而2種納米乳液的界面面積又遠大于油凝膠,更大的界面面積有助于增加油和胃液的接觸面積,因此更容易加快脂解。

圖6 油凝膠及2種油凝膠納米乳液中游離脂肪酸的釋放Fig.6 Release profile of free fatty acids in oleogel and oleogel-based nanoemulsions

2.7 蝦青素的生物可利用率

由圖7可知,2種油凝膠納米乳液中蝦青素的生物可利用率顯著高于油凝膠,且乳清分離蛋白納米乳液中蝦青素的生物可利用率高于雞蛋清白蛋白,此現象可由油凝膠和納米乳液的脂解程度來解釋。由脂質消化過程產生的游離脂肪酸可以形成膠束,且疏水性蝦青素主要通過這些脂肪酸膠束的增溶而被機體吸收利用。模擬胃腸消化后,油凝膠納米乳液體系中產生了更多的游離脂肪酸,進而得到了更多的脂肪酸膠束,使更多的蝦青素溶解,從而提高蝦青素的生物可利用率。研究蝦青素的生物可利用率有重大的意義,課題組之前的研究表明蝦青素的生物可利用率不到5%[12],而在乳清分離蛋白穩定的油凝膠納米乳液中,蝦青素的生物利用率達到了43.6%,提升了近40%,說明該油凝膠納米乳液體系可以作為優秀的營養物遞送系統,具有很高的營養生物可及性。

圖7 體外模擬消化后蝦青素在不同體系中的生物利用率Fig.7 Bioaccessibility of astaxanthin in different systems after in vitro digestion

3 結論

本研究以小燭樹蠟作為凝膠劑,形成油凝膠所需的小燭樹蠟最低質量分數為1.2%；通過對小燭樹蠟油凝膠的凝膠轉變點、硬度、流變性等一系列的表征,結果顯示小燭樹蠟質量分數為2%的油凝膠在各個方面的理化性質均優于1.2%,表明在一定質量分數范圍內,小燭樹蠟含量的提高有助于提升油凝膠的凝膠轉變點、硬度和流變性；采用乳清分離蛋白和雞蛋清白蛋白作為乳化劑,制備油凝膠納米乳液,結果表明乳清分離蛋白組乳液的粒徑更小、ζ-電位更高,穩定性更強；對包埋蝦青素的油凝膠和納米乳液的體外模擬消化研究表明,納米乳液的脂解率更高,且油凝膠納米乳液體系中蝦青素的生物可利用率均遠高于油凝膠。此外,相比雞蛋清白蛋白穩定的油凝膠納米乳液,乳清分離蛋白穩定的油凝膠乳液具有更高的脂解率和生物可利用率。本研究為蝦青素的高效利用提供了一種新思路,在將來有望應用于食品工業中。