蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化活性及其協同作用研究

張濤,鄧思,陳艷紅,2,3,4*,杜希萍,2,3,4

1(集美大學 食品與生物工程學院,福建 廈門,361021)2(福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建 廈門,361021)3(廈門市食品與生物工程技術研究中心,福建 廈門,361021)4(廈門南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點實驗室,福建 廈門,361021)

法夫酵母因是天然蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素)的重要來源而受到廣泛關注[5-9]。研究報道蝦青素具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗癌[12]以及預防心血管疾病等多種生理活性[13]。法夫酵母具有類胡蘿卜素合成的復雜途徑[14-16]。在之前的研究中,從法夫酵母提取物中鑒定出蝦青素、β-胡蘿卜素、玉米黃質、β-隱黃素和番茄紅素等多種類胡蘿卜素[17]。這些類胡蘿卜素由于結構相似很難分離。目前,它們生理活性之間的相互作用還不清楚。本文采用DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率、·OH清除率、鐵離子還原能力、抗油脂過氧化能力和ORAC法評價蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化能力,并以DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH清除率為指標研究蝦青素和β-胡蘿卜素以不同濃度組合的抗氧化效果,為利用法夫酵母開發高效的抗氧化劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦青素(100%,USP級)、β-胡蘿卜素(≥95%,(HPLC級),美國Sigma-Aldrich公司；2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；甲醇、水楊酸、過硫化鉀、K2HPO4、FeSO4·7H2O、FeCl3, 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司;熒光素鈉、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、水溶性維生素E(Trolox),均為分析純，北京索萊寶科學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Mettler Toledo電子天平,順迪嘉奧有限公司；BMG全波長自動多功能酶標儀微孔板檢測儀,廣州伯齊生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定

用甲醇將8.00 mg DPPH配成濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液,用甲醇制備質量濃度為2、4、8、16、32、64 μg/mL的蝦青素或β-胡蘿卜素的待測液。在96孔酶標板中依次加入50 μL DPPH自由基溶液和50 μL待測液,30 ℃反應30 min,于517 nm波長下測定吸光度值。維生素E(VE)作為陽性對照,3次平行實驗,清除率由公式(1)計算[18]：

(1)

式中：A0,待測液用甲醇替代,加入DPPH自由基的吸光度；AX,添加待測液和DPPH自由基的吸光度；A1,加入待測液,DPPH自由基用甲醇替代的吸光度。

1.3.2 ABTS陽離子自由基清除率的測定

用蒸餾水分別配制7 mmol/L的ABTS陽離子自由基溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8溶液,均勻混合,常溫避光15 h,之后將混合液用甲醇制成734 nm波長下吸光度為(0.70±0.02)的工作液。將10 μL 1.3.1所述待測液和200 μL ABTS陽離子自由基工作液依次加入96孔酶標板中,30 ℃反應6 min,測定734 nm波長處吸光度。以VE作為陽性對照,3次平行實驗,清除率由公式(2)計算[19]：

(2)

式中：A0,待測液用甲醇替代,加入ABTS陽離子自由基的吸光度；AX,添加待測液和ABTS陽離子自由基的吸光度。

1.3.3 ·OH清除率的測定

將50 μL 2.25 mmol/L FeSO4水溶液、50 μL 9 mmol/L水楊酸甲醇溶液、50 μL 1.3.1所述待測液依次加入96孔酶標板中,再加入50 μL 8.80 mmol/L H2O2甲醇溶液啟動反應,37 ℃反應30 min,測定510 nm波長處吸光度A。以VE作為陽性對照,3次平行實驗,清除率由公式(3)計算[20]：

(3)

式中：Ax,添加待測液時的吸光度；A0,待測液用甲醇替代時的吸光度；A1,水楊酸甲醇溶液和H2O2甲醇溶液均用甲醇替代時的吸光度。

1.3.4 鐵離子還原能力測定

參考BENZIE等[21]的方法并略加修改。以pH 3.6醋酸鈉緩沖溶液∶20 mmol/L FeCl3水溶液∶10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪鹽酸溶液(10∶1∶1,體積比)混合制成鐵離子還原/抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)工作液。在96孔酶標板中依次加入5 μL不同濃度的FeSO4溶液(50、100、200、400、800、1 600 μmol/L)、150 μL FRAP工作液和15 μL 蒸餾水,混勻,37 ℃避光,每隔10 min測定595 nm波長處吸光度。橫坐標為FeSO4溶液濃度,縱坐標為吸光度,得到標準曲線y=0.269 2x+0.014 1,R2=0.999 4。測定鐵離子還原能力：將5 μL 64 μg/mL待測液、150 μL FRAP工作液和15 μL 蒸餾水依次加入96孔酶標板中,混勻,37 ℃避光,每隔10 min測定595 nm波長處吸光度。陽性對照為VE,3次平行實驗,以達到相同吸光度所需FeSO4濃度表示待測液的鐵離子還原能力。

1.3.5 抗油脂過氧化能力測定

實驗分成4組,空白組(35 mL橄欖油)、蝦青素組(0.007 5 g蝦青素+35 mL橄欖油)、β-胡蘿卜素組(0.007 5 g β-胡蘿卜素+35 mL橄欖油)和VE組(0.007 5 g VE+35 mL橄欖油)。所有實驗3個平行,密封,60 ℃放置,每天根據GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中滴定法測定過氧化值。過氧化值以每千克中活性氧的毫克當量(meq/kg)表示。

1.3.6 氧自由基吸收能力(oxygen-radical absorbance capacity,ORAC)法評價抗氧化能力

按照徐維盛等[22]報道ORAC法評價抗氧化能力。熒光素鈉、自由基產生劑2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide,dihydrochlori,AAPH)、抗氧化標準物質Trolox均用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋到適當濃度。設置空白孔、對照孔、不同濃度的標準溶液孔(Trolox)和樣品孔。在96孔黑色酶標板中依次加入25 μL待測樣、150 μL 86.1 nmol /L熒光素鈉溶液,37 ℃溫育10 min,迅速加入25 μL 153 mmol/L AAPH溶液啟動反應。以激發波長485 nm,發射波長538 nm連續測定熒光強度,每隔2 min 測定1次熒光值,每次測定前中速振動孔板10 s。熒光衰減呈基線后停止測定,將每次測定的值與初始熒光強度的比值記為fn。根據公式(4)計算各孔熒光強度曲線下的面積(area under the curve,AUC),減掉空白孔的AUC,即得到各孔的Net AUC,根據不同濃度Trolox的Net AUC做標準曲線,計算各樣品的ORAC值,待測樣品的ORAC值以μmol TE/g表示,具體按公式(5)計算：

AUC=2×(f0+f1+f2+…fn-1+fn)-f0-fn

(4)

(5)

1.4 協同抗氧化活性的測定

1.4.1 DPPH自由基清除率的測定

以2、4、8、16 μg/mL 4個劑量對蝦青素和β-胡蘿卜素進行兩兩組合,方法同1.3.1。

1.4.2 ABTS陽離子自由基清除率的測定

以2、4、8、16 μg/mL 4個劑量對蝦青素和β-胡蘿卜素進行兩兩組合,方法同1.3.2。

1.4.3 ·OH清除率的測定

以2、4、8、16 μg/mL 4個劑量對蝦青素和β-胡蘿卜素進行兩兩組合,方法同1.3.3。

1.5 數據分析

用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析,結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除率及協同作用

由圖1可知,質量濃度2～64 μg/mL時,蝦青素、β-胡蘿卜素和VE均具有DPPH自由基清除能力,并且呈劑量依賴性。16～64 μg/mL時,蝦青素對DPPH自由基清除能力顯著強于β-胡蘿卜素和VE(P<0.05)；當蝦青素為64 μg/mL時,蝦青素對DPPH自由基的清除率為(71.61±3.01)%。蝦青素對DPPH自由基的半最大效應濃度(EC50)值為(29.95±3.01)μg/mL,而在試驗濃度范圍內未計算出β-胡蘿卜素和VE的EC50值。

圖1 不同質量濃度蝦青素、β-胡蘿卜素和VE對DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH scavenging ability of different concentration of astaxanthin,β-carotene and VE

由表1可知,不同質量濃度的β-胡蘿卜素與蝦青素(16 μg/mL除外)組合對DPPH自由基清除率有協同作用,8 μg/mL蝦青素與8 μg/mL β-胡蘿卜素組合協同作用最強,協同作用值為16.78%。但16 μg/mL的蝦青素與任意濃度的β-胡蘿卜素組合均表現為拮抗。

表1 不同質量濃度蝦青素和β-胡蘿卜素組合的DPPH自由基清除能力的值及相互作用關系Table 1 DPPH radical scavenging capacity value and interaction effect of astaxanthin and β-carotene at different concentration

進一步分析發現當β-胡蘿卜素質量濃度較高(8或16 μg/mL)時,增大蝦青素的質量濃度(2～8 μg/mL)有促進協同作用的趨勢；當β-胡蘿卜素質量濃度較低(2或4 μg/mL)時,協同作用隨蝦青素濃度的增加(2～8 μg/mL)呈先上升后下降的趨勢。結果表明,DPPH自由基抗氧化組合中,高質量濃度蝦青素(16 μg/mL)與β-胡蘿卜素組合不利于兩者產生協同抗氧化作用。

2.2 ABTS陽離子自由基清除率及協同作用

由圖2可知,蝦青素、β-胡蘿卜素和VE在試驗濃度范圍(2～64 μg/mL)內,除β-胡蘿卜素在16 μg/mL時對ABTS陽離子自由基清除率略有下降,其余對ABTS陽離子自由基清除率均呈現出劑量依賴性。蝦青素的EC50值為(61.21±4.17)μg/mL,而β-胡蘿卜素和VE在試驗濃度范圍內未計算出EC50值。此外,在8～64 μg/mL的試驗濃度范圍內,蝦青素清除ABTS陽離子自由基能力強于β-胡蘿卜素和VE,當質量濃度為64 μg/mL時,蝦青素對ABTS陽離子自由基的清除率最高,為(51.17±1.17)%。

圖2 蝦青素、β-胡蘿卜素、VE的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.2 ABTS cationic radical scavenging ability of astaxanthin,β-carotene and VE

由表2可知,除16 μg/mL蝦青素與2 μg/mL β-胡蘿卜素的組合外,蝦青素與任意濃度的β-胡蘿卜素組合均對ABTS陽離子自由基清除率有協同作用；協同作用最強為8 μg/mL蝦青素與8 μg/mL β-胡蘿卜素組合,協同作用值為63.64%；而16 μg/mL蝦青素與2 μg/mL β-胡蘿卜素的拮抗作用值為11.39%。總體來看,當β-胡蘿卜素質量濃度為2 μg/mL時,增大蝦青素的濃度有促進拮抗作用的趨勢；當蝦青素質量濃度為16 μg/mL時,協同作用隨β-胡蘿卜素濃度的增加而增強。結果表明,ABTS陽離子自由基抗氧化組合中,高質量濃度的蝦青素(16 μg/mL)與低質量濃度的β-胡蘿卜素(2 μg/mL)組合不利于兩者產生抗氧化協同作用。

表2 不同濃度蝦青素和β-胡蘿卜素組合的ABTS陽離子自由基清除率的值及相互作用關系Table 2 ABTS cationic radical scavenging capacity value and interaction effect of astaxanthin and β-carotene at different concentrations

2.3 ·OH清除率及協同作用

由圖3可知,在2～64 μg/mL的質量濃度范圍內,蝦青素、β-胡蘿卜素和VE具有·OH清除活性。蝦青素的·OH清除率顯著高于β-胡蘿卜素和VE,當蝦青素質量濃度為64 μg/mL時,其對·OH的清除率最高,為(69.82±1.72)%。蝦青素的EC50值為(26.12±5.14)μg/mL,VE和β-胡蘿卜素在試驗濃度范圍內均未計算出EC50值。蝦青素和VE的·OH清除率隨濃度的增加均呈現上升的趨勢,且表現出明顯的量效關系,β-胡蘿卜素的·OH清除率在試驗濃度范圍內變化不大,且呈現出波動趨勢,無明顯的量效關系。

圖3 蝦青素、β-胡蘿卜素、VE的·OH清除率Fig.3 ·OH free radical scavenging ability of astaxanthin,β-carotene and VE

由表3可知,樣品在2～16 μg/mL,蝦青素與β-胡蘿卜素組合的·OH抗氧化活性相互作用情況復雜。低質量濃度β-胡蘿卜素(2或4 μg/mL)與不同濃度蝦青素的組合對·OH清除能力有協同作用,16 μg/mL蝦青素與2 μg/mL β-胡蘿卜素的協同作用最大,為9.03%。但是,高質量濃度β-胡蘿卜素(8或16 μg/mL)與不同質量濃度蝦青素(2 μg/mL蝦青素除外)的組合有拮抗作用,最強為16 μg/mL β-胡蘿卜素與8 μg/mL蝦青素組合,拮抗作用值為9.33%。·OH抗氧化組合中,較高質量濃度的蝦青素(4～16 μg/mL)與較高質量濃度的β-胡蘿卜素(8或16 μg/mL)結合不利于兩者產生協同抗氧化作用。

表3 不同濃度蝦青素和β-胡蘿卜素組合的·OH清除能力的值及相互作用關系Table 3 ·OH radical scavenging capacity value and interaction effect of astaxanthin and β-carotene at different concentrations

2.4 鐵離子還原能力

由圖4可知,β-胡蘿卜素、蝦青素和VE均具有鐵離子還原能力。當質量濃度為64 μg/mL時,β-胡蘿卜素、蝦青素和VE的FRAP值分別為(0.1200±0.011)、(0.2816±0.005)和(0.1020±0.0012)mmol/L。可見,蝦青素的鐵離子還原能力強于β-胡蘿卜素和陽性對照VE,VE的鐵離子還原能力最弱。

圖4 β-胡蘿卜素、蝦青素和VE的鐵離子還原能力Fig.4 Iron ion reduction ability of β-carotene,astaxanthin and VE

2.5 抗油脂過氧化作用

由圖5可知,所有組橄欖油的過氧化值均隨著放置時間的增加而逐漸增大,添加蝦青素、β-胡蘿卜素和VE后橄欖油的過氧化值減小,說明它們具有一定的抗油脂過氧化作用。5 d后,蝦青素、β-胡蘿卜素和VE處理組的過氧化值分別為(3.50±0.10)、(7.60±0.11)和(5.34±0.02)meq/kg。可見,蝦青素抗油脂的過氧化能力最強,β-胡蘿卜素抗油脂的過氧化能力最弱。據文獻報道,VE具有長鏈飽和烴基結構,而蝦青素比VE具有更多的可置換結構和不飽和雙鍵[23],這種可置換結構可能導致蝦青素具有比VE更強的抗油脂過氧化作用[24]。

圖5 蝦青素、β-胡蘿卜素、VE的抗油脂過氧化作用Fig.5 Antiperoxide effects of astaxanthin,β-carotene and VE

2.6 ORAC法評價抗氧化能力

由圖6可知,無抗氧化劑Trolox時,熒光衰退很明顯；添加Trolox會抑制熒光衰退速度,并且抑制作用隨Trolox濃度增大而逐漸增強。根據橫坐標是Trolox濃度,縱坐標是凈面積,得到Trolox標準溶液的標準曲線y=1.015 5x+0.095 6,R2=0.996。

圖6 不同濃度Trolox標準溶液熒光隨時間衰減曲線Fig.6 Time course of the reaction of fluoresce with AAPH in the presence of Trolox standard solution無自由基的熒光素鈉溶液熒光自然衰減對照；AAPH+：不含抗氧化劑的自由基對照；Trolox1～Trolox4：加入6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L Trolox標準溶液時熒光強度衰減的影響

圖7為蝦青素、β-胡蘿卜素熒光隨時間衰減曲線，根據衰減曲線計算出凈面積。依據標準曲線得到蝦青素的ORAC值為(4 325±11.79)μmol TE/g,β-胡蘿卜素的ORAC值為(2 029±10.01)μmol TE/g,蝦青素的ORAC值顯著高于β-胡蘿卜素的ORAC值,說明蝦青素具有更強的抗氧化活性。

圖7 蝦青素、β-胡蘿卜素熒光隨時間衰減曲線Fig.7 Time course of the reaction of fluoresce with AAPH in the presence of astaxanthin and β-carotene

3 討論

抗氧化體外評價方法因具有快速便捷的特點而被廣泛應用。本文選擇了6種抗氧化方法全面評價蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化活性。結果表明,在6種抗氧化實驗中,蝦青素和β-胡蘿卜素均具有抗氧化活性。其中蝦青素對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·OH清除率最強,其EC50值分別為(29.95±3.01)、(61.21±4.17)和(26.12±5.14)μg/mL；當AAPH-：質量濃度為64 μg/mL時,蝦青素和β-胡蘿卜素的FRAP值分別為(0.281 6±0.005)和(0.120 0±0.011)mmol/L；5 d后,蝦青素和β-胡蘿卜素的過氧化值分別為(3.50±0.10)和(7.60±0.11)meq/kg；在相同濃度下蝦青素和β-胡蘿卜素的ORAC值分別為(4 325±11.79)和(2 029±10.01)μmol TE/g。綜上,蝦青素的抗氧化能力優于β-胡蘿卜素,此結果與LIU等[25]研究結果一致。蝦青素具有獨特的化學性質,蝦青素骨架中的共軛雙鍵及末端的不飽和酮基和羥基相互作用,加劇分子之間的摩擦力度,可以促進電子的自由移動,自由基負責提供電子與未配對電子相互吸引,能有效地淬滅附近的自由基及有害的活性氧[26]。據報道,蝦青素除了不飽和多烯鏈在膜中捕獲自由基外,其極性末端環部分能夠通過分子間和分子內氫鍵捕獲膜內和膜表面的自由基,從而在幾種抗氧化體系中表現出比β-胡蘿卜素更強的抗氧化能力[27-29]。

抗氧化劑組合的抗氧化能力大于相同劑量的單一抗氧化劑時,則抗氧化劑間存在協同作用,且抗氧化劑濃度和反應體系等會影響協同作用效果。低效的抗氧化劑黃芩苷與β-胡蘿卜素組合后在由自由基引發的脂質氧化反應中表現出顯著的協同作用[30]。黃芩苷的共軛基團有助于黃芩苷-β-胡蘿卜素抗脂質過氧化協同作用的產生,其機制與葛根素-β-胡蘿卜素的協同作用相似[31]。本文研究發現,蝦青素和β-胡蘿卜素組合對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·OH清除率具有協同作用。此研究結果與LIANG等[32]報道蝦青素與類胡蘿卜素在脂相具有協同作用一致。這是由于類胡蘿卜素的空間分布,蝦青素固定在脂質/水界面,來自引發劑2,2′-偶氮雙(2,4-二甲基戊腈)的初始自由基氧化蝦青素生成自由基陽離子,與大豆卵磷脂氧化競爭,由于共振穩定作用,蝦青素自由基陽離子中的單電子被重新定位到類胡蘿卜素多烯鏈的中心,多烯鏈可以在細胞膜的親脂性中心從還原性更強的類胡蘿卜素β-胡蘿卜素中提取一個電子,從而以β-胡蘿卜素為代價再生蝦青素。蝦青素起著自由基橋的作用,將分子內部還原性更強的類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素)的電子傳遞到具有高偶極矩自由基集中的界面。研究發現,高濃度蝦青素與β-胡蘿卜素組合不利于協同抗氧化作用的產生。許颯等[33]研究結果顯示,當VC濃度較高,類胡蘿卜素濃度較低時,兩者組合具有較好的協同抗氧化作用；但是當類胡蘿卜素增加至一定濃度時,兩者組合沒有表現出抗氧化協同作用。丁健等[34]研究表明,當VC為10 mg/mL,類胡蘿卜素與VC質量濃度比值≤1.5時,或VE為0.384 mg/mL,類胡蘿卜素與VE質量濃度比值≤1.5時,類胡蘿卜素與VC或VE具有明顯的助氧化作用；而當VC或VE濃度較低時,VC或VE將加速類胡蘿卜素的降解。本研究結果顯示,16 μg/mL蝦青素與任意濃度β-胡蘿卜素組合對DPPH自由基清除率比未混合前2種單體清除能力之和低,表現為拮抗作用；高濃度的蝦青素與低濃度的β-胡蘿卜素結合對ABTS陽離子自由基清除率以及較高濃度的蝦青素與較高濃度的β-胡蘿卜素結合對·OH清除率均表現出拮抗作用。抗氧化劑之間的拮抗現象可能是由于抗氧化劑自由基加合物的形成或抗氧化劑再生之間的競爭,以及一種抗氧化劑的微環境被另一種抗氧化劑改變所造成的[35]。

4 結論

本研究發現在多種抗氧化評價體系中,蝦青素的抗氧化能力均強于β-胡蘿卜素,并且蝦青素和β-胡蘿卜素組合對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和·OH清除率具有協同作用。因此可應用蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化協同作用開發高效的抗氧化劑。同時可采用水溶性、成膜性、生物降解性良好的明膠和穩定性、溶解性、增稠性良好的麥芽糊精為微膠囊壁材,采用噴霧干燥法制備蝦青素和β-胡蘿卜素微膠囊,以避免光和氧等因素作用下類胡蘿卜素的降解和異構化。綜上,本文的研究結果為利用法夫酵母開發高效的抗氧化劑提供了理論依據。