Lactobacillus reuteri 121 4,6-α-葡萄糖基轉移酶GtfBdN改性薯類淀粉產物結構及理化特性研究

蔣彤,紀杭燕,柏玉香*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)3(江南大學 食品安全與營養協同創新中心,江蘇 無錫,214122)4(食品安全國際聯合實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

Lactobacillusreuteri121 GtfB是首個在糖苷水解酶70(glycoside hydrolase 70,GH70)家族中發現的對蔗糖無活性的4,6-α-葡萄糖基轉移酶(4,6-α-glucanotransferase,4,6-α-GTase),能夠作用于麥芽低聚糖和淀粉,斷裂(α1→4)鍵并形成連續的(α1→6)鍵[1-2]。N端截斷的GtfB(GtfBdN)不僅具有全活性,而且能夠高表達,并且它的酶活力測定方法也已被建立[3]。另外,也已獲得GtfBdNdV的晶體結構[4]。繼LactobacillusreuteriGtfB發現之后,來自LactobacillusreuteriDSM 20016和ML1的GTFW和GTFML4的發現需要構建GH70一個新的亞家族[5],即GtfB-型酶。GtfC-型酶[6]和GtfD-型酶[7-8]與GtfB-型酶[9-11]一起構成了GH70中作用淀粉底物的3個新的亞家族。而Lactobacillusreuteri121 GtfB是3個亞家族中研究最多的一個酶。

利用Lactobacillusreuteri121 GtfBdN改性多種淀粉得到異麥芽/麥芽多糖(isomalto/malto-polysaccharide,IMMP),區分了IMMP中引入的線性(α1→6)鍵和淀粉中天然的(α1→4,6)分支點,表明(α1→4,6)分支點的存在會影響GtfBdN的轉糖基活性[12]。以酶特異性降解的方式揭示IMMP的亞結構,并測定了新引入的(α1→6)連接的糖苷鏈及其(α1→4)連接的糖苷受體鏈的鏈長分布,表明對于(α1→4)連接的糖苷鏈,GtfBdN更傾向于使用線性(α1→6)連接的糖苷鏈作為受體[13]。對來自多種淀粉和麥芽糊精經GtfB改性得到的IMMP進行表征,表明其為一種水溶性膳食纖維,并且證明長鏈線性(α1→4)葡聚糖鏈的底物能夠得到具有更高(α1→6)鍵百分比的產物[14]。將GtfB或GtfBdN作用于不同淀粉底物,得到含有不同(α1→6)鍵比例的IMMP,將其在體外發酵人糞便表征它的腸道發酵特性,結果表明在所有IMMP發酵過程中,總體微生物多樣性以及雙歧桿菌和乳桿菌的相對豐度顯著增加,證明IMMP是具有益生元潛力的可緩慢發酵的纖維[15]。

基于以上研究現狀,對Lactobacillusreuteri121 GtfB的研究多集中于其改性淀粉的產物作為膳食纖維和益生元分析與結構的關聯方面,缺乏與應用相關的產物本身理化性質的測定。前人研究中,紅薯淀粉和馬鈴薯淀粉經Lactobacillusreuteri121 GtfBdN改性后產物與對照相比,在結構上具有比較明顯的差別[12-13]。因此,本研究選擇薯類淀粉作為底物,包括紅薯淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉,利用Lactobacillusreuteri121 GtfBdN進行改性,并對改性后的產物進行結構和理化性質測定,以期為4,6-α-GTase改性薯類淀粉在食品體系中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設備

紅薯淀粉(直鏈淀粉質量分數為29%)、木薯淀粉(直鏈淀粉質量分數為23%)、馬鈴薯淀粉(直鏈淀粉質量分數為34%),杭州普羅星淀粉有限公司；GtfBdN,實驗室儲藏；異淀粉酶(EC3.2.1.68),愛爾蘭Megazyme公司；直鏈淀粉,美國Sigma Aldrich公司；其他試劑均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

Avance Ⅲ 400 MHZ全數字化核磁共振波譜儀,德國布魯克公司；DAWN HELEOS Ⅱ 高效尺寸排阻色譜儀-多角度激光光散射-折光檢測器,美國懷雅特技術公司；ICS—5000+高效陰離子交換色譜儀-脈沖安培檢測器,美國賽默飛世爾科技公司；RVA 4500快速黏度分析儀,波通澳大利亞公司；DHR-3流變儀,美國沃特世公司；X-DSC7000差示掃描量熱儀,日本精工電子納米科技有限公司。

1.2 GtfBdN的表達、純化及酶活力測定

參考BAI等[3]酶的表達、純化和酶活力測定方法,并稍作修改。從實驗室保藏菌種中挑取菌液接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中,于37 ℃、200 r/min的條件下培養10 h得到種子液。以體積分數1%的接種量,將種子液接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中,37 ℃、200 r/min條件下擴大培養,直至OD600值為0.4～0.6。之后取出冰浴15 min,加入異丙基硫代半乳糖苷至終濃度為1 mmol/L,于18 ℃、160 r/min培養24 h誘導產酶。在4 ℃、10 000 r/min的條件下離心10 min,收集菌體。按照1 g菌體溶于5～6 mL 20 mmol/L Tris-HCl(250 mmol/L NaCl,pH 7.5)將菌體重懸,于冰浴中超聲破壁20 min。破壁后的菌液在4 ℃、10 000 r/min的條件下離心30 min,收集上清液即為粗酶液。利用鎳親和層析對粗酶液進行純化,依次用20 mmol/L Tris-HCl(250 mmol/L NaCl,pH 7.5)和含有不同濃度咪唑的20 mmol/L Tris-HCl(250 mmol/L NaCl,pH 7.5)進行洗脫,收集每部分的流穿液,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶驗證。將得到的純酶進行酶活力測定,用于后續試驗。

1.3 GtfBdN改性薯類淀粉

將紅薯淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉分別分散于醋酸鈉緩沖液(25 mmol/L,pH 5)中配制成50 mg/mL的淀粉乳,沸水浴30 min充分糊化。稍作冷卻后40 ℃保溫15 min,分別添加GtfBdN(1.32 U/g干基淀粉)反應24 h,沸水浴15 min停止反應。反應樣品冷卻至室溫后加入2倍體積無水乙醇醇沉12 h,于4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min,收集沉淀置于40 ℃烘箱中烘干,研磨過100目篩備用。改性前的對照為不添加酶經過上述相同處理的薯類淀粉。

1.4 鍵型比例測定

將1.3中所述樣品以質量濃度20 mg/mL分別分散于重水中,沸水浴1 h,每隔10 min渦旋振蕩一次使其均勻分散。于-80 ℃冷凍過夜,真空干燥2 d。上述操作循環2次,測定時復溶于重水中。在400 MHz全數字化核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)波譜儀上記錄一維核磁共振光譜,譜寬為8 000 Hz。所有光譜均使用MestReNova 12.0.3處理。

1.5 相對分子質量測定

參考JI等[16]的樣品處理方法和測試條件并稍作修改。流動相流速為0.5 mL/min,在上樣前以8倍體積無水乙醇醇沉2 h,收集沉淀復溶于流動相中,煮沸至澄清透明,在高效尺寸排阻色譜(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)上進樣。利用Astra 5.3.4對數據進行分析。

1.6 鏈長分布測定

測試條件參考CHANG等[17]的方法,樣品前處理方法如下,將1.3中所述樣品分別分散于醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L,pH 4.5)中配制成2 mg/mL的淀粉乳,煮沸30 min充分糊化。取1.5 mL糊化的樣品在42 ℃保溫15 min,加入2 U異淀粉酶脫支,充分反應24 h。反應結束后在95 ℃滅酶10 min,5 000 r/min離心2 min,將上清液稀釋10倍后過0.22 μm水膜。

1.7 糊化特性測定

將1.3中所述樣品各3 g加入25 g去離子水制成懸浮液,置于快速黏度分析儀 (rapid visco-analyzer,RVA)專用的測試鋁盒中,并用配套的塑料攪拌槳不停攪拌防止淀粉顆粒沉降。參考BHAT等[18]的測試條件,按照設定的程序進行測定。

1.8 黏彈特性測定

將1.3中所述樣品分別以去離子水配制成質量濃度為50 mg/mL的淀粉乳,沸水浴30 min完全糊化,冷卻至室溫。固定溫度為25 ℃,間隙為1 mm,平板直徑為4 cm,將樣品置于流變儀上,對樣品進行動態流變測試。在進行動態流變測試前,首先測定各個樣品的線性黏彈區,在0.001%～1 000%的應變范圍內以1 Hz的恒定頻率進行應變掃描,得到各樣品線性黏彈區域的范圍。然后固定應變,在0.1～100 rad/s的角頻率范圍內進行頻率掃描,獲得彈性模量(elastic modulus,G′)、黏性模量(viscous modulus,G″)隨角頻率變化的關系曲線。

1.9 回生特性測定

將1.3中所述樣品各2～4 mg置于差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)配套的坩堝中,按照1∶2(g∶mL)的比例加入去離子水,壓片密封。室溫平衡12 h以上,以空坩堝為參比,將各樣品放入DSC中進行糊化。溫度掃描范圍20～95 ℃,升溫速率10 ℃/min。糊化后的樣品立即放入4 ℃冰箱中貯存1、3、5、7、14和21 d用于測定回生焓。

1.10 數據處理

2 結果與分析

2.1 GtfBdN改性對淀粉分子結構的影響

2.1.1 鍵型比例分析

圖1為一維核磁共振氫譜測得的(α1→4)鍵和(α1→6)鍵含量的譜圖。化學位移在5.4 ppm左右處的峰對應于(α1→4)鍵,化學位移在5.0 ppm左右處的峰對應于(α1→6)鍵。未經改性的淀粉中(α1→6)鍵含量均低于5.0%[12,19],而經GtfBdN改性的紅薯淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉中(α1→6)鍵所占比例分別為20.7%、19.5%和26.6%,表明GtfBdN改性使3種薯類淀粉中均引入了新的(α1→6)鍵。根據前人的研究,產物中新形成的(α1→6)鍵是線性(α1→6)鍵[12]。

a-紅薯淀粉；b-木薯淀粉；c-馬鈴薯淀粉圖1 三種薯類淀粉經GtfBdN改性后的核磁共振波譜圖Fig.1 The NMR spectra of three kinds of tuber starches modified by GtfBdN

2.1.2 相對分子質量分析

糊化后的3種薯類淀粉與其各自對應的GtfBdN改性產物在HPSEC上的洗脫曲線如圖2所示。改性前淀粉的洗脫表面積均小于其對應的GtfBdN改性產物的洗脫表面積,并且改性前淀粉的出峰時間早于GtfBdN改性產物的出峰時間。BELLO-PEREZ等[20]研究了處理方法對于淀粉樣品溶解度的影響,發現一般的處理方法均會使所得樣品受到損失。由于改性前淀粉與GtfBdN改性產物的處理方式與上樣量均相同,洗脫表面積的不同表明兩者被洗脫的程度不同。因此,改性前淀粉本身的溶解度以及能夠被流動相洗脫的程度與GtfBdN改性產物之間存在差異可能是導致兩者洗脫表面積不同的原因。紅薯淀粉和木薯淀粉均在洗脫體積為12.5 mL左右出現第1個峰,其各自對應的GtfBdN改性產物均在14.0 mL左右出現第1個峰。而馬鈴薯淀粉的第1個出峰時間約為13.5 mL,其經GtfBdN改性后產物的第1個出峰時間約為16.0 mL。可以看出,以上3種薯類淀粉在經過GtfBdN改性后,出峰時間發生較為明顯的右移。這表明GtfBdN改性產物分子質量變小,且GtfBdN可以修飾底物中的支鏈淀粉部分。從圖2中還觀察到馬鈴薯淀粉經GtfBdN改性后產物的洗脫曲線與另外2種淀粉改性后產物的洗脫曲線形狀不同,猜測可能與馬鈴薯淀粉具有較高的平均支鏈淀粉鏈長有關[12]。

a-紅薯淀粉；b-木薯淀粉；c-馬鈴薯淀粉圖2 三種薯類淀粉經GtfBdN改性前后的示差折光信號色譜圖Fig.2 Chromatograms of differential refractive signal of three kinds of tuber starches before and after modification by GtfBdN

糊化后3種薯類淀粉與其各自對應的GtfBdN改性產物的分子質量分布信息如表1所示。由表1可以看出,改性前3種薯類淀粉分子質量Mw數量級均為107,旋轉半徑(radius of gyration,Rw)較大,多分散系數(polydispersity index,PDI)較小,與前人的文獻報道相一致[21-22]。而經GtfBdN改性后產物的Mw數量級變為105,Rw減小,PDI增加。這表明糊化的3種薯類淀粉均被GtfBdN水解成為較小的分子,這些分子在溶液中占據的當量球體體積減小,體系中分子種類增多,分子質量分布變廣。

表1 三種薯類淀粉經GtfBdN改性前后的分子質量分布Table 1 The molecular weight distribution of three kinds of tuber starches before and after modification by GtfBdN

2.1.3 鏈長分布分析

表2為糊化后的3種薯類淀粉及其各自對應的GtfBdN改性產物的鏈段變化情況。將鏈長根據聚合度(degree of polymerization,DP)分為以下4個部分：DP 6～12為A鏈,DP 13～24為B1鏈,DP 25～36為B2鏈,DP ≥37為B3鏈[23]。由表2可知,各樣品B1鏈的相對含量最高。GtfBdN改性后產物均表現出B2和B3鏈相對含量降低,A鏈相對含量增加的現象。紅薯淀粉和木薯淀粉經GtfBdN改性后B1鏈相對含量增加,而馬鈴薯淀粉經GtfBdN改性后B1鏈的相對含量略有降低。紅薯淀粉經GtfBdN改性后B2鏈的相對含量減少了39.6%,B3鏈的相對含量減少了40.5%,A鏈的相對含量增加了150.0%,B1鏈的相對含量增加了9.9%。木薯淀粉經GtfBdN改性后B2鏈的相對含量減少了50.3%,B3鏈的相對含量減少了46.2%,A鏈的相對含量增加了162.2%,B1鏈的相對含量增加了18.1%。馬鈴薯淀粉經GtfBdN改性后B2鏈的相對含量減少了23.1%,B3鏈的相對含量減少了33.8%,A鏈的相對含量增加了200.0%,B1鏈的相對含量減少了2.7%。比較3種薯類淀粉利用GtfBdN改性后產物與改性前淀粉的鏈段分布模式可知,GtfBdN傾向于水解B2鏈和B3鏈,從而使這2個鏈段的相對含量減少。淀粉分子的結構變化將不可避免的影響淀粉的理化性質。

表2 三種薯類淀粉經GtfBdN改性前后的鏈段變化Table 2 Chain segment changes of three kinds of tuber starches before and after modification by GtfBdN

2.2 GtfBdN改性對淀粉理化性質的影響

2.2.1 糊化特性分析

圖3為糊化后的3種薯類淀粉及其各自對應的GtfBdN改性產物的RVA曲線。由圖3可知，改性前的淀粉均呈現典型的RVA曲線,存在峰值黏度、谷值黏度、終值黏度、糊化溫度、崩解值和回生值。但經過GtfBdN改性后產物的RVA曲線中這些特征值消失,均表現出黏度大幅下降的現象。峰值黏度與水的結合能力有關。GtfBdN改性產物峰值黏度的消失,表明其與水結合的能力減弱,加熱期間不易溶脹[24],這可能是淀粉分子的結構發生變化所引起的。終值黏度和谷值黏度的差值為回生值,可以作為短期回生的參考,短期回生的快慢主要取決于直鏈淀粉的含量與聚集速度[25]。GtfBdN改性產物回生值消失,表明其短期不易回生。而改性前淀粉中直鏈淀粉含量比較高,有利于在淀粉回生的初始階段直鏈淀粉間的聚集,因此改性前淀粉的短期回生較快。而GtfBdN能夠水解直鏈淀粉中的(α1→4)鍵,使得經GtfBdN改性后產物中直鏈淀粉含量減少,進而使得改性產物中直鏈淀粉的聚集速度變慢,能夠延緩短期回生。因此,可將改性后的產物應用于飲料等流體食品中,既能滿足流體食品低黏度的特質,又能使其不易沉淀,更加均一穩定。

a-紅薯淀粉；b-木薯淀粉；c-馬鈴薯淀粉圖3 三種薯類淀粉經GtfBdN改性前后的RVA曲線Fig.3 RVA curves of three kinds of tuber starches before and after modification by GtfBdN

2.2.2 黏彈特性分析

圖4為糊化后的3種薯類淀粉及其各自對應的GtfBdN改性產物的動態流變曲線。G′為彈性模量,表示樣品在形變中具有的能量,能夠反映樣品在形變后恢復原樣的能力；G″為黏性模量,表示樣品在形變中因抵抗外力而損失的能量,能夠反映樣品的抗流動能力[26]。由圖4可知,改性前3種薯類淀粉的G′和G″均隨角頻率的增加而增加。在整個測試范圍內,紅薯淀粉和馬鈴薯淀粉改性前的G′均高于G″,表明它們均趨向于形成固態的凝膠。而木薯淀粉改性前G″高于G′,表現為類液體行為。對于3種經GtfBdN改性后的產物而言,在測試范圍內G′和G″均存在交叉,這表明它們存在過渡黏彈性[27]。在交叉頻率以下G′G″,表明彈性行為僅在短時間內占主導地位。在整個測試范圍內,未改性淀粉的G′和G″均大于其對應的GtfBdN改性產物。3種薯類淀粉經GtfBdN改性后動態流變行為的轉變可能與淀粉分子的結構改變,其被降解為較小的分子有關[28]。

a-紅薯淀粉；b-木薯淀粉；c-馬鈴薯淀粉圖4 三種薯類淀粉經GtfBdN改性前后的動態流變曲線Fig.4 Dynamic rheological curves of three kinds of tuber starches before and after modification by GtfBdN

2.2.3 回生特性分析

糊化后的3種薯類淀粉及其各自對應的GtfBdN改性產物在4 ℃儲藏不同時間后回生焓的變化情況見表3。在回生過程中,淀粉的直鏈淀粉主要負責短期回生,而長期回生則由支鏈部分主導,但是直鏈淀粉在后期也參與直鏈淀粉和支鏈淀粉雙螺旋的聚集,對回生起協同作用[29]。由表3可知,所有樣品的回生焓值都隨儲藏時間的增加而增加,表明樣品在儲藏期間發生了重結晶,樣品重結晶程度的不同,導致最終的回生焓值不同。對比改性前后淀粉的回生焓發現,GtfBdN改性后產物在不同儲藏時間下的回生焓值減小。表明在長期回生中,GtfBdN改性產物能夠延緩回生。這個現象可在側鏈分布的結果中得到證實,DP>24的鏈段相對含量減少,DP 6～12的鏈段相對含量大大增加,不利于雙螺旋的形成,因而能夠延緩長期回生[30]。因此,將改性后的產物應用于面包等烘焙食品中,可改善因淀粉回生引起的不良感官品質。

表3 三種薯類淀粉經GtfBdN改性前后的回生焓值Table 3 The retrogradation enthalpy of three kinds of tuber starches before and after modification by GtfBdN

3 結論

將紅薯淀粉、木薯淀粉和馬鈴薯淀粉3種薯類淀粉利用GtfBdN進行改性,測定產物的結構和理化性質。GtfBdN改性使產物中均引入了新的(α1→6)鍵,產物的相對分子質量減小,體系中分子種類增多,GtfBdN傾向于水解比較長的外側鏈,導致長鏈所占比例降低,短鏈所占比例增加。這些結構的變化使其理化性質也發生改變。GtfBdN改性后產物的黏度大幅下降,短期回生變慢。改性后的產物更接近于流體,GtfBdN改性能夠延緩長期回生。因此,經GtfBdN改性后的產物可以應用于飲料、米糊、面包等食品中,在符合原有應用場景的前提下,還能夠起到減緩回生的效果,使食品品質得到改善和提高。這將為4,6-α-GTase改性薯類淀粉在食品體系中的應用提供一定基礎。