氧甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因ploy (A)加尾促進(jìn)粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素能力研究

孫楊,王麗君,楊套偉,付維來,易敢峰,饒志明,2*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)3(大北農(nóng)水產(chǎn)科技集團(tuán),福建 詔安,363500)

靈菌紅素 (prodigiosin，PG)是一類含三吡咯骨架結(jié)構(gòu)的天然紅色素，主要由粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、天藍(lán)色鏈霉菌等微生物產(chǎn)生，具有抗癌、免疫抑制、抗蟲等多種生物活性，可作為免疫抑制劑和抗癌藥物進(jìn)行開發(fā)，受到研究者的廣泛關(guān)注[1-3]。S.marcescens可以在30 ℃下高效生產(chǎn)靈菌紅素，但在37 ℃或更高溫度下幾乎無法生產(chǎn)[4-5]。如圖1所示，在S.marcescens中，靈菌紅素的合成受分叉路徑的控制，2-甲基-3-n-戊基吡咯(2-methyl-3-n-amyl-pyrrole, MAP)和4-甲氧基-2,2′-聯(lián)吡咯-5-甲醛(4-methoxy-2,2′-bipyrrole-5-carbaldehyde, MBC)在PigC的作用下縮合生成靈菌紅素[6]。MBC分支的最后一步是由PigF和PigN催化，將甲基轉(zhuǎn)移至4-羥基-2,2′-聯(lián)吡咯-5-甲醛(4-hydroxy-2,2′-bipyrrole-5-carbaldehyde, HBC)形成MBC[7]。

圖1 粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素生物合成途徑Fig.1 Prodigiosin biosynthetic pathway in S.marcescens

聚腺苷酸化是指將未模板化的腺苷殘基添加到RNA底物的3′末端的酶促過程[8-9]。盡管早在1962年就在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了第一個poly(A)聚合酶,但多年來細(xì)菌中的聚腺苷酸化很少受到關(guān)注[10]。聚腺苷酸化廣泛用于控制RNA代謝,包括mRNA代謝回轉(zhuǎn)和RNA穩(wěn)定性監(jiān)測[11]。在大腸桿菌中,在poly(A)聚合酶的作用下,poly(A)尾巴可在mRNA的3′端形成[12]。先前的研究表明,加工過的轉(zhuǎn)錄本和3′末端的穩(wěn)定RNA結(jié)構(gòu)可以賦予3′-5′核酸外切酶抗降解的能力,因此可以保護(hù)鄰近的上游區(qū)域免受體內(nèi)核酸外切降解的影響[13]。但是,與真核生物不同的是,在細(xì)菌mRNA中只有一小部分是聚腺苷酸化的,而實(shí)際的聚腺苷酸化程度只有少數(shù)轉(zhuǎn)錄本,其水平可低至0.4%～10%[9,14-15]。

在本研究中,選擇實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到并能合成PG的粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1為出發(fā)菌株,利用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生5.36 g/L的靈菌紅素。對粘質(zhì)沙雷氏菌來源的氧甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase,PigF)進(jìn)行表達(dá),并通過在粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1靈菌紅素合成基因簇pigF3′端添加poly(A/T)尾來提高pigF轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。最終,發(fā)酵最高可產(chǎn)生6.21 g/L靈菌紅素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1、JNB5-1ΔpigF、大腸桿菌(Escherichiacoil)BL21 (DE3)、大腸桿菌S17-1 λ pir及質(zhì)粒pET-28a、pETC-28a、pUT-km均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。大腸桿菌S17-1 λ pir/pUT-km-pigFP-Apm、JNB5-1F、JNB5-1FP1～JNB5-1FP6,JNB5-1ΔpigFF、JNB5-1ΔpigFFP1～JNB5-1ΔpigFFP6及JNB5-1/pigFFP菌株,為本文構(gòu)建。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶、λ-Hind III digest DNA Marker、DL10000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、蛋白marker,大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒、RNA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

本研究中PCR擴(kuò)增所用引物通過蘇州金唯智生物科技有限公司來合成,引物如表1所示。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used for PCR in this study

堿基為酶切位點(diǎn),小寫字母是同源臂用于同源重組

1.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10；pH 7.0,固體培養(yǎng)基則加1.5%～2%的瓊脂粉,121 ℃滅菌20 min。根據(jù)實(shí)際需要添加適量的抗生素。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖20、牛肉膏15、CaCl210、脯氨酸7.5、MgSO4·7H2O 0.2、FeSO4·7H2O 0.06；pH 7.0,121 ℃滅菌20 min；粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵用。

大腸桿菌培養(yǎng)溫度37 ℃,旋轉(zhuǎn)式搖床180 r/min；粘質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)溫度30 ℃,旋轉(zhuǎn)式搖床200 r/min。

1.2 重組菌株的構(gòu)建與表達(dá)

1.2.1pigF基因的克隆

根據(jù)GenBank中粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素合成基因簇基因組序列(登錄號：AJ833002.1)中pigF基因序列設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物(pigF-F/pigF-R),以粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1的基因組DNA為模板擴(kuò)增pigF。利用同源重組試劑盒將所得目的基因片段與線性化pET-28a載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,在50 μg/mL卡那霉素抗性平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后,送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.2 poly(A/T)尾的篩選

以粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1的基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增分別獲得3′端連接(或沒有連接)有不同poly(A/T)尾的氧甲基轉(zhuǎn)移酶的pigF、pigF1～pigF6；將pigF、pigF1～pigF6分別與pETC-28a(pET-28a衍生質(zhì)粒,氯霉素抗性,T7啟動子被替換為中等強(qiáng)度啟動子P14[16])質(zhì)粒經(jīng)BamH I/SacI雙酶切后連接,得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并涂布在LB固體培養(yǎng)基(含12.5 μg/mL氯霉素)上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)8～12 h,挑取陽性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行驗(yàn)證(BamH I/SacI),驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海生工測序,確認(rèn)poly(A/T)尾連接到pigF基因,測序正確即獲得大腸桿菌BL21/pETC-28a-pigF、BL21/pETC-28a-pigF1～BL21/pETC-28a-pigF6和重組質(zhì)粒pETC-28a-pigF、pETC-28a-pigF1～pETC-28a-pigF6。將上述驗(yàn)證成功質(zhì)粒分別以轉(zhuǎn)化的方式(同大腸桿菌轉(zhuǎn)化法)轉(zhuǎn)化至粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1和粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1ΔpigF,得到JNB5-1F,JNB5-1FP1～JNB5-1FP6,JNB5-1ΔpigFF及JNB5-1ΔpigFFP1～JNB5-1ΔpigFFP6菌株。

1.2.3 重組粘質(zhì)沙雷氏菌的構(gòu)建

以粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1的基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增分別獲得3′端連接有核苷酸序列如 “AAAAAA”所示的poly(A/T)尾的靈菌紅素合成基因簇pigF(引物：pigFU F/pigFU R)、安普霉素抗性基因片段Apm(pigF)(引物：ApmF/ApmR)以及下游片段pigFD(引物：pigFD F/pigFD R)。通過同源重組試劑盒將上述片段與經(jīng)KpnI/SacI雙酶切的pUT-km質(zhì)粒依次相連,得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1 λ pir并涂布在含有50 μg/mL安普霉素的LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)8～12 h,挑取轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行驗(yàn)證以及測序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確即獲得大腸桿菌S17-1 λ pir/pUT-km-pigFP-Apm和敲入質(zhì)粒pUT-km-pigFP-Apm。將大腸桿菌S17-1 λ pir/pUT-km-pigFP-Apm和粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1分別接種至LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)16 h,將培養(yǎng)液離心并收集上述2種菌菌體,在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng),通過接合轉(zhuǎn)移的方式將敲入質(zhì)粒pUT-km-pigFP-Apm轉(zhuǎn)移至粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1中。接合轉(zhuǎn)移后涂布在LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL安普霉素和50 μg/mL克林霉素)上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～24 h,得到粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1/pigFFP；挑取陽性子接種至LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)8～12 h穩(wěn)定遺傳3代,得到培養(yǎng)液；對培養(yǎng)液提基因組并通過PCR擴(kuò)增(pigFU F/Apm(pigF) R)單菌落中pigFU-Apm基因驗(yàn)證,擴(kuò)增成功即獲得粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1/pigFFP。

1.3 PigF誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)驗(yàn)證的大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子活化,然后轉(zhuǎn)接至含50 μg/mL卡那霉素的50 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)至OD約0.6～0.8時進(jìn)行IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)誘導(dǎo),16 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。將誘導(dǎo)的菌液于4 ℃ 5 000×g離心5 min,收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體3次,重懸細(xì)胞后經(jīng)超聲波破碎得粗酶液。

1.4 PigF酶活力的測定

參考ARNOW[17]的方法進(jìn)行,反應(yīng)體系包括50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4(pH 7.0)、1 mmol/L DTT、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L SAM、1 mmol/L 3,4-二羥基苯甲酸和適量純化的酶。將上述反應(yīng)混合物混勻后在30 ℃水浴中反應(yīng)25 min,加入1 mL 0.5 mmol/L HCl溶液終止反應(yīng)。然后分別加入1 mL 10% NaNO2、10% NaMoO4和1 mol/L NaOH溶液,混勻后測定光吸收值A(chǔ)510。以未加酶的反應(yīng)液作為對照。酶活力單位定義：一個活力單位(U)為標(biāo)準(zhǔn)條件下每1 min甲基化1 μmol 3,4-二羥基苯甲酸所需的酶量。

蛋白含量采用Bradford法[18]測定。

1.5 mRNA半衰期測定

mRNA半衰期測定：菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期,先在沒有利福平的情況下取樣,然后用200 μg/mL利福平處理。加入利福平后0、2、4、6、8和10 min離心收集細(xì)胞。提取RNA并進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。RNA提取和實(shí)時熒光定量PCR方法參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以0 min轉(zhuǎn)錄水平為100%,后面每1次取樣的轉(zhuǎn)錄水平為相對轉(zhuǎn)錄水平,取ln值,繪制以時間為橫軸的散點(diǎn)圖,計(jì)算其斜率k值,然后帶入公式t1/2=ln2/k計(jì)算半衰期t1/2。

1.6 靈菌紅素含量的測定

以酸性乙醇為空白對照,取發(fā)酵液溶解到酸性乙醇(pH 3.0)中,得到樣品；將樣品做適度的稀釋(50、250、1 000倍),得到稀釋樣品；將稀釋樣品密封放置8 h(充分溶解PG)后3 276×g離心10 min,取上清液；測定上清液的A535值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.193 6X-0.001計(jì)算得到發(fā)酵液中PG的含量。其中,Y代表A535值,X代表靈菌紅素產(chǎn)量,單位mg/100 mL。

1.7 重組菌株發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素

菌株經(jīng)平板活化后,挑取單菌落分別接入至LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL安普霉素和50 μg/mL克林霉素)中,于30 ℃、180 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)16 h,得到種子液；將種子液以體積分?jǐn)?shù)6%接種量接種至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)96 h,每隔12 h獲得培養(yǎng)液,測靈菌紅素產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對S.marcecens JNB5-1合成靈菌紅素的影響

粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1在30 ℃可以高效合成靈菌紅素,在37 ℃甚至更高溫度低效甚至無法合成靈菌紅素[4]。將粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1分別在不同溫度(20～40 ℃)條件下發(fā)酵培養(yǎng),結(jié)果如圖2-a所示。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于30 ℃時,菌株JNB5-1合成靈菌紅素的產(chǎn)量隨著溫度的升高而逐漸增加,并在30 ℃時產(chǎn)量達(dá)到最大值；隨著溫度進(jìn)一步升高,靈菌紅素產(chǎn)量迅速下降,當(dāng)溫度高于37 ℃時,菌株JNB5-1基本不再合成靈菌紅素 (圖2-b)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,粘質(zhì)沙雷氏菌的生存溫度范圍比較寬泛(20～40 ℃),而靈菌紅素的合成卻需要相對嚴(yán)格的溫度(24～30 ℃)。

a-粘質(zhì)沙雷氏菌在30 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下?lián)u瓶中產(chǎn)靈菌紅素特征；b-不同溫度對靈菌紅素產(chǎn)量影響圖2 S.marcecens JNB5-1在不同溫度下靈菌紅素產(chǎn)量Fig.2 Production of prodigiosin in S.marcecens JNB5-1 at different temperatures

2.2 poly(A/T)尾對pigF轉(zhuǎn)錄水平的影響

本課題組利用雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分離和鑒定出JNB5-1中涉及靈菌紅素合成的關(guān)鍵酶 PigF在28 ℃時蛋白表達(dá)水平相較37 ℃提高了7.4倍[19],同時轉(zhuǎn)錄組及qPCR得到了一致趨勢的結(jié)果。溫度對酶表達(dá)量和酶活力的影響主要包括轉(zhuǎn)錄過程和翻譯過程的影響,而粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素受溫度調(diào)節(jié)的機(jī)制目前仍不清楚。本研究計(jì)劃先考察PigF在轉(zhuǎn)錄水平上受到溫度影響情況。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,基因聚腺苷酸化可以有效減緩mRNA降解速率,人工添加poly (A)尾聚腺苷酸化基因可以提高其mRNA穩(wěn)定性,進(jìn)而提高目標(biāo)酶的表達(dá)量和酶活力[9,14],因此,考慮采用人工添加poly (A)尾策略提高pigF基因mRNA穩(wěn)定性,進(jìn)而提高PigF表達(dá)量和酶活力,考察其對粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的影響。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20],本研究在pigF3′端添加6條不同長度poly(A/T)尾(圖3-a),連接至pETC-28a質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至粘質(zhì)沙雷氏菌和粘質(zhì)沙雷氏菌△pigF敲除菌體內(nèi),并置于30和37 ℃下培養(yǎng),觀察pigF在轉(zhuǎn)錄水平上的變化。由圖3-b可知,在粘質(zhì)沙雷氏菌體內(nèi),在添加poly(A/T)尾后,轉(zhuǎn)錄水平都有不同程度提升,其中JNB5-1FP5和JNB5-1FP6相對其他菌株提升較為明顯,分別提高了69.3%和77.8%,且在37 ℃提升幅度大于較30 ℃,分別提高了1.36倍和1.17倍。在粘質(zhì)沙雷氏菌△pigF敲除菌體內(nèi)表達(dá)帶有3′端帶有poly(A/T)尾pigF時,發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(圖3-c)。

a-以pigF為靶基因添加6種不同PNT,黑色序列是pigF基因的最后10個堿基對,斜體字母是PNT；b-在粘質(zhì)沙雷氏菌中驗(yàn)證poly(A/T)尾的功能在粘質(zhì)沙雷氏菌中驗(yàn)證poly(A/T)尾的功能；c-在粘質(zhì)沙雷氏菌△pigF敲除菌中中驗(yàn)證poly(A/T)尾的功能在粘質(zhì)沙雷氏菌中驗(yàn)證poly(A/T)尾的功能；d-添加不同poly(A/T)尾對30 ℃培養(yǎng)的粘質(zhì)沙雷氏菌pigF基因半衰期的影響。圖3 poly(A/T)尾對粘質(zhì)沙雷氏菌中pigF的影響Fig.3 Effect of poly(A/T)tails on pigF in S.marcescens

由于聚腺苷酸化可以有效減緩mRNA降解速率,為了確認(rèn)加尾部分是否在轉(zhuǎn)錄的mRNA中得到體現(xiàn),對JNB5-1、JNB5-1FP1～JNB5-1FP6中pigF基因半衰期進(jìn)行測定。如圖3-d所示,JNB5-1FP1～JNB5-1FP6中的pigF基因半衰期較原始菌株均有所提高,其中JNB5-1FP6中pigF半衰期(4.35 min)較JNB5-1中pigF半衰期(2.82 min)提高了54.6%,表明在添加poly(A/T)尾后可以有效緩解pigF降解,提高pigF轉(zhuǎn)錄水平。

結(jié)果顯示,在pigF3′端添加6條不同長度poly(A/T)尾可以使得聚腺苷酸化水平得到提升,從而保護(hù)mRNA避免被降解,獲得了較高的轉(zhuǎn)錄本水平。

2.3 PigF誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測定

將膠回收的pigF片段與線性化的pET-28a連接,構(gòu)建重組載體pET-28a-pigF,然后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。獲得陽性轉(zhuǎn)化子后提取重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒pET-28a-pigF經(jīng)單雙酶切驗(yàn)證,得到5369 bp和1017 bp大小的片段,分別對應(yīng)pET-28a和pigF的大小。結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pET-28a-pigF構(gòu)建成功(圖4-a)。

a-重組質(zhì)粒pET-28a-pigF酶切驗(yàn)證；M1-DL2000 DNA Marker；M2-λ-Hind III digest DNA Marker；1-pET-28a-pigF單切驗(yàn)證；2-pET-28a-pigF雙切驗(yàn)證;b-重組菌全細(xì)胞蛋白及PigF純化后SDS-PAGE電泳圖,M-Protein Marker；1-純化的PigF；2-重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pigF上清液；3-重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a上清液圖4 重組pigF構(gòu)建及其表達(dá)Fig.4 Construction and expression of recombinant pigF

根據(jù)1.3小節(jié)所述的方法對E.coliBL21(DE3)/pET-28a-pigF進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集經(jīng)IPTG過夜誘導(dǎo)的重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-pigF菌體,超聲波破碎,取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖4-b)。結(jié)果表明,重組酶蛋白表達(dá)良好,其表觀分子質(zhì)量約為37 kDa。為了檢測PigF酶活力,采用比色法體外測定法,在體外酶活力測定結(jié)果顯示PigF對3,4-二羥基苯甲酸催化活性為48 U/mg(表2)。

表2 重組蛋白PigF比酶活力Table 2 Specific enzyme activity of recombinant PigF

2.4 poly(A/T)尾對PigF酶活力的影響

為了研究poly(A/T)尾對PigF酶活力的影響,將JNB5-1F,JNB5-1FP1～JNB5-1FP6菌株置于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h,超聲波破碎細(xì)胞得粗酶液。根據(jù)1.4小節(jié)所述的方法測定PigF酶活力。如圖5所示,在粘質(zhì)沙雷氏菌中,當(dāng)pigF基因3′端添加6條不同長度poly(A/T)尾后,PigF酶活力有不同程度的提高。具體而言,JNB5-1FP6取得最大的比酶活力為3.12 U/mg,相對于對照提高了41.8%(圖5)。該結(jié)果表明poly(A/T)尾的存在可以提高氧甲基轉(zhuǎn)移酶酶活力。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用“AAAAAA”poly(A/T)尾進(jìn)行研究。

圖5 不同poly(A/T)尾對酶活力的影響Fig.5 Effect of poly(A/T)tails on enzyme activity

結(jié)果表明,當(dāng)poly(A/T)尾與pigF基因連接時,獲得了很高的氧甲基轉(zhuǎn)移酶酶活性水平。當(dāng)pigF基因過表達(dá)時,3′端的poly(A/T)尾部導(dǎo)致pigF轉(zhuǎn)錄水平增加,因此pigF在JNB5-1FP1～JNB5-1FP6中的轉(zhuǎn)錄豐度得到了提高,暗示由于poly(A/T)尾,pigF基因在粘質(zhì)沙雷氏菌中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)得到了增強(qiáng)。結(jié)果表明,mRNA上短的poly(A/T)尾的存在可以通過增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性來顯著增強(qiáng)后續(xù)翻譯過程。

2.5 poly(A/T)尾整合到粘質(zhì)沙雷氏菌染色體上的影響

為了克服質(zhì)粒的不穩(wěn)定,將3’端帶有“AAAAAA”的pigF替換pig基因簇上原有的pigF,得到重組菌JNB5-1/pigFFP。根據(jù)GenBank中粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素合成基因簇基因組序列(登錄號：AJ833002.1)中pigF基因序列(基因大小1 017 bp)。采用pUT-km敲入系統(tǒng)[21],經(jīng)接合轉(zhuǎn)移和同源重組完成基因敲入。通過PCR擴(kuò)增單菌落中pigFU-pigF-Apm(pigF)重組基因(約1 940 bp,結(jié)果見圖6),鑒定與測序結(jié)果顯示,PCR條帶在2 000左右,與理論值相一致(圖6)。結(jié)果表明3′端帶有“AAAAAA”的pigF替換成功,獲得重組菌JNB5-1/pigFFP。

M-DL10000 DNA Marker;1-JNB5-1/pigFFP1 PCR驗(yàn)證結(jié)果;2-JNB5-1/pigFFP2 PCR驗(yàn)證結(jié)果圖6 重組粘質(zhì)沙雷氏菌PCR擴(kuò)增鑒定Fig.6 PCR identification of recombinant S.marcescens

2.6 poly(A/T)尾對搖瓶中靈菌紅素產(chǎn)量的影響

為了進(jìn)一步研究重組菌JNB5-1/pigFFP合成靈菌紅素的能力,將重組菌JNB5-1/pigFFP菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵測試,在發(fā)酵期間,每隔12 h對發(fā)酵液進(jìn)行取樣并檢測靈菌紅素含量。由圖7可知,重組菌JNB5-1/pigFFP合成靈菌紅素產(chǎn)量相對于原始菌株具有較大的提高。具體而言,在生長初級階段,重組菌JNB5-1/pigFFP的生長要滯后于JNB5-1,當(dāng)進(jìn)入到對數(shù)期后,兩者生長差異較小,菌株也開始大量合成靈菌紅素；兩者在84 h后開始進(jìn)入衰退期,靈菌紅素產(chǎn)量開始下降。菌株發(fā)酵至84 h,OD600達(dá)到最高,此時靈菌紅素含量積累到最高點(diǎn),JNB5-1中靈菌紅素高達(dá)(5.36±0.06)g/L,而重組菌JNB5-1/pigFFP中靈菌紅素也達(dá)到(6.21±0.37)g/L。可見,在重組菌JNB5-1/pigFFP可以實(shí)現(xiàn)更高效合成靈菌紅素。

圖7 重組粘質(zhì)沙雷氏菌菌合成靈菌紅素?fù)u瓶發(fā)酵過程Fig.7 Shake flask fermentation process of synthetic prodigiosin in recombinant S.marcescens

3 討論

WILLIAMSON等[22]發(fā)現(xiàn),ΔpigF突變體中產(chǎn)生了由MAP和HBC合成的一種副產(chǎn)物,使菌落在PGM瓊脂上呈現(xiàn)橙色。在前期的研究中,與28 ℃相比,參與靈菌紅素合成的PigF在37 ℃時顯著下調(diào)[19]。以上結(jié)果表明,PigF的表達(dá)量和酶活力對粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的水平具有重要影響。而相對低的溫度不但有利于蛋白的穩(wěn)定性,同時也有利于mRNA的穩(wěn)定性,而mRNA的穩(wěn)定性決定了目標(biāo)酶的表達(dá)量。mRNA是一個動態(tài)過程,主要包括轉(zhuǎn)錄,降解和翻譯,在3′-UTR的下游添加poly(A/T)尾巴可以提高目標(biāo)基因mRNA穩(wěn)定性,從而提高了目標(biāo)酶的表達(dá)量和酶活力[23]。從這一點(diǎn)來看,粘質(zhì)沙雷氏菌中pigF表達(dá)水平的提高可能是由于poly(A/T)尾巴在維持mRNA穩(wěn)定性和避免快速降解方面起著重要作用[24](圖3-d),最終,通過給pigF添加poly(A/T)尾提高了粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素的能力。在這項(xiàng)研究中,poly(A/T)尾與其他可用的調(diào)控元件(包括啟動子[25],核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)[26]和終止子[27])相比具有許多優(yōu)勢。首先,使用poly(A/T)尾巴作為遺傳操縱工具很方便,可以通過合成引物引入,考慮到長poly(A/T)尾的不穩(wěn)定性,我們設(shè)計(jì)了最長的poly(A/T)尾僅12 nt[28-29]。其次,poly(A/T)尾巴只能促進(jìn)靶基因的mRNA穩(wěn)定性,而對靶基因的上游和下游基因影響很小,因此可以調(diào)節(jié)基因簇中單個基因的強(qiáng)度而不影響其他基因的表達(dá),對pig基因簇的反應(yīng)良好[30]。第三,相對于強(qiáng)啟動子增強(qiáng)基因的表達(dá),它在代謝工程中以給定的強(qiáng)度增加基因的表達(dá),只要輔以相對弱的多的啟動子就能達(dá)到相同的效果,因此減輕了細(xì)胞負(fù)擔(dān)。總之,在粘質(zhì)沙雷氏菌中通過添加poly(A/T)尾巴可提高靈菌紅素產(chǎn)量,為代謝改造微生物提高靈菌紅素產(chǎn)量提供了可借鑒的思路。