模擬冷鏈流通中溫度波動對腐敗希瓦氏菌的生長及其腐敗產物的影響

錢韻芳,林婷,曹維,葉晶鑫,謝晶*,楊勝平*

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306)3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺,上海,201306)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦,是當今世界上養殖產量最高的三大蝦類優良品種之一[1]。凡納濱對蝦營養豐富,也極易發生細菌腐敗。研究認為水產品的腐敗變質主要由一系列化學和物理變化引起,其中微生物活動在該系列變化中起主要作用[2-3]。腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是凡納濱對蝦中的優勢腐敗菌之一,因其較強的致腐敗能力而受到國內外學者的關注[4-6]。其具有較強的蛋白質分解和產生胺類化合物的能力,是目前冷鏈流通中水產品常見的特定腐敗菌[7]。為延長水產品在貯運過程中的保鮮期,常采用冷藏鏈流通方式來抑制腐敗菌的生長,但由于現階段存在冷鏈運輸裝備、操作不規范等問題,在運輸過程中容易出現“斷鏈”情況,引發溫度波動,進而影響水產品保鮮品質[8-10]。目前研究多關注水產品品質變化,未從溫度波動對微生物生長以及其代謝產物的影響進行分析。為研究冷鏈流通過程中溫度波動對腐敗希瓦氏菌的生長及其致腐敗能力的影響,本文使用提取的凡納濱對蝦汁為腐敗菌生長代謝提供營養,模擬冷鏈流通過程中的3種溫度狀態,分析蝦汁中腐敗希瓦氏菌的生長情況及總氨基酸含量、生物胺含量等理化指標的變化,分析溫度波動引起水產品品質劣變的原因,為建立有效冷鏈流通體系,發展水產品貯運保鮮技術提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗原料與菌株

1.1.1 實驗原料

凡納濱對蝦購自上海市蘆潮港碼頭,蝦質量為13～15 g,長度為14～15 cm,保活運抵實驗室后用碎冰猝死,冰水洗凈,稍晾干待用。

1.1.2 供試菌株

菌株：腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciensQY38,NCBI Accession：KX692894)為前期冷藏凡納濱對蝦貨架期終點分離純化并鑒定獲得的菌株,并于-80 ℃保藏。

1.2 試劑與儀器

丹磺酰氯(優級純)、乙酸銨(優級純)、乙腈(色譜純),上海安譜科學儀器有限公司；鐵瓊脂(iron agar,IA)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB),青島高科園海博生物技術有限公司；鹽酸、NaOH、NaCl、輕質氧化鎂、NaOCO3、HClO4均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸標品、生物胺標品,均為優級純, Sigma試劑公司。

LC-2010C HT型高效液相色譜儀,日本島津公司；Kjeltec2300型凱氏定氮儀,丹麥FOSS公司；HVE-50高壓滅菌鍋,日本Hirayama公司；VS-1300L-U超凈工作臺,蘇凈安泰集團；TDL-5-型離心機,上海隆拓儀器設備公司；835氨基酸自動分析儀,日本日立公司；Sarrtorius PB-10酸度計,德國賽多利斯集團。

1.3 樣品預處理及無菌蝦汁的制備

為盡可能避免全蝦或蝦仁中存在的原始雜菌對實驗結果的干擾,本實驗采用經高壓蒸汽滅菌后的蝦汁作為腐敗希瓦氏菌的培養基。參考謝晶等[11]的方法,將凡納濱對蝦運抵實驗室后用冰水洗凈并去頭、去尾、去蝦線,攪碎過濾收集濾液,并用高壓滅菌鍋121 ℃下滅菌30 min備用。

1.4 腐敗菌(希瓦氏菌)菌株活化

將該菌株于TSB中在30 ℃下培養24 h,使菌液濃度達1.0×108CFU/mL,再取1 mL接種于TSB中,培養約12 h左右至菌液濃度達到105CFU/mL后待用[12]。

1.5 接種與貯藏

將滅菌的蝦汁冷卻至室溫,隨機分為3組,其中A1、B1、C1組分別加入0.01 mL腐敗希瓦氏菌菌液,對照組A2、B2、C2分別加入0.01 mL無菌TSB培養液。混勻后將各組置于不同溫度貯藏如圖1所示(模擬3種不同的冷鏈流通過程),對于A1、B1、C1組每24 h取1次樣,測定相關指標。對A2、B2、C2組各取3次樣(96、144和192 h),測定相關指標。

圖1 凡納濱對蝦蝦汁模擬冷鏈流通溫度波動過程Fig.1 Simulated situations of temperature changes of Pacific white shrimp juice注:(+)為接種菌液實驗組;(-)為對照組

1.6 菌落數的測定

參考YE等[12]的方法進行。

1.7 pH值的測定

吸取5 mL蝦汁樣品于燒杯中,加入無菌水至50 mL,攪拌均勻后靜置30 min,用pH計進行測定,每組樣品做2個平行[8]。

1.8 揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)的測定

取5 mL蝦汁樣品,用凱氏定氮儀測定[12]。

1.9 總氨基酸的測定

參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[13]的方法進行測定。

1.10 凡納濱對蝦蝦汁生物胺的測定

吸取4 mL蝦汁樣品,參考謝晶等[14]的方法進行測定。

1.11 致腐敗能力分析

以貯運終點時1 CFU的腐敗菌產生的腐敗代謝產物TVB-N、腐胺、尸胺為指標[15]。腐敗代謝產物產量因子YTVB-N/CFU、Y腐胺/CFU、Y尸胺/CFU分別按公式(1)、(2)、(3)計算：

(1)

(2)

(3)

式中：N0、Ns,初始點、貯運終點時的總菌數,CFU/g；(TVB-N)0、(TVB-N)s,初始點、貯運終點時的TVB-N量,mg N/g；腐胺0、腐胺s,初始點、貯運終點時的腐胺含量,mg/kg；尸胺0、尸胺s,初始點、貯運終點時的腐胺含量,mg/kg。

1.12 數據分析

使用Origin 8.5軟件繪圖,采用SPSS 19.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌菌落總數變化

腐敗希瓦氏菌生長情況如圖2所示。接菌的蝦汁初始菌落數為5.05 lg CFU/g,與新鮮對蝦的菌落數相近[16],對照組蝦汁因經過滅菌未檢測到初始菌落,且整個流通過程中都沒有增加,說明滅菌效果良好,因此未在圖中顯示。由圖2可知,A1組蝦汁在10 ℃下貯藏24 h內腐敗希瓦氏菌菌落數迅速上升,96 h時達到穩定期,為9.49 lg CFU/g,從168 h開始,A1組的菌落總數開始呈現下降趨勢,可能是由于微生物進入衰亡期。B1組由于一直處于4 ℃條件下,其腐敗希瓦氏菌生長緩慢,至192 h菌落數為9.08 lg(CFU/g)且其變化仍呈上升趨勢。C1組的菌落數在前24 h內的增長情況與B1組相同,之后進入10 ℃的模擬運輸過程中,其菌落數快速上升,運輸96 h后基本達到穩定期,菌落數為9.10 lg CFU/g,當菌落數達到109CFU/g后溫度重新降至4 ℃也不能降低其菌落數。結果表明,低溫和溫度波動并不影響腐敗希瓦氏菌生長的最大菌落數,但會顯著影響其增長速率,尤其是微生物快速增長的貯藏初期一旦發生溫度波動會顯著增大微生物的基數,即使溫度重新降低也難以起到良好的抑制效果。張寧等[17]對于三文魚的類似研究也發現頻繁的溫度波動可導致菌落總數上升。

圖2 不同冷鏈流通條件下腐敗希瓦氏菌在凡納濱對蝦汁中的生長情況Fig.2 Growth of S.putrefaciens inoculated in Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.2 pH值變化

在內源酶和微生物的作用下產生一系列化學反應可導致水產品pH值發生變化[18]。3種不同冷鏈流通條件下凡納濱對蝦蝦汁pH值的變化如圖3所示,A1、B1、C1實驗組的pH值均呈現顯著的上升趨勢,而A2、B2、C2空白對照組的pH值均維持在6.91～6.97左右。貯藏24 h后3組實驗組的pH值開始上升,可能是腐敗希瓦氏菌分解蝦汁中的蛋白質并積累了堿性含氮物質引起的[19]。實驗結果表明,A1在72 h時pH值達到7.03,B1組pH值在168 h時才達到7.02,而C1組的pH值在96 h時就超過7.00。A1、C1組pH值變化與B1組存在較大差異,說明腐敗微生物生長導致pH的增加與溫度波動存在一定關系。

圖3 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁pH值變化Fig.3 pH value of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.3 TVB-N變化

水產品蛋白質在微生物和內源酶的共同作用下分解為肽和氨基酸等,氨基酸可繼續被降解為小分子揮發性的堿性含氮物質,其可用TVB-N表示[14]。本研究蝦汁TVB-N值變化如圖4所示。不同流通條件下接菌后蝦汁的TVB-N值均呈顯著上升趨勢,空白對照組的TVB-N值在整個過程中基本保持平穩。

圖4 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁TVB-N值變化Fig.4 TVB-N contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

B1組由于全程處于4 ℃條件下,與其他實驗組相比其TVB-N含量水平較低,貯藏192 h時含量為13.11 mg/100 g。A1組在48 h后TVB-N開始快速上升,C1組TVB-N相對A1組變化較緩,但兩者在冷鏈末期TVB-N含量較為接近,分別為28.29和25.91 mg/100 g,明顯高于B1組和空白對照組,說明溫度波動可導致腐敗產物的增加,與楊勝平等[8]研究冰鮮帶魚在冷鏈流通中隨溫度波動的品質變化結果相一致。常大偉等[20]研究發現,溫度波動會破壞肌纖維結構,增加溶酶體數量,加速魚肉蛋白質的分解。A1、B1、C1樣品的TVB-N上升趨勢與細菌菌落數的增長呈一定相關性,說明TVB-N變化與微生物間存在聯系。

2.4 總氨基酸含量變化

作為優質蛋白的來源,水產品富含氨基酸,而氨基酸又是大部分腐敗產物的前體化合物[21],因此本文測定了蝦汁中總氨基酸含量的變化。根據實驗組在整個貯藏過程中腐敗希瓦氏菌菌落總數和TVB-N含量的變化趨勢,分別選取了A1組在第0、24、96和192 h；B1組在第0、96、120和192 h；C1組在第0、48、96和192 h；A2、B2、C2組分別在第0和192 h時進行總氨基酸含量的測定,其含量變化如圖5所示。結果顯示,蝦汁總氨基酸的初始值為276.87 mg/g,在3種不同冷鏈條件的流通中,總氨基酸的含量均呈下降趨勢。在貯運終點(192 h)時,A2、B2和C2對照組總氨基酸含量略有下降,且各組變化幅度相近,這可能是與游離氨基酸氧化分解有關,而A1、B1、C1實驗組的總氨基酸含量出現顯著下降,分別為170.48、169.51和160.92 mg/g,說明腐敗希瓦氏菌的生長繁殖需要消耗蝦汁中的氨基酸。C1組中蝦汁總氨基酸含量下降幅度最大,其所處的冷鏈流通中的溫度波動頻率最高,因此推測溫度波動促進了腐敗希瓦氏菌的代謝活動,進而加速氨基酸的降解導致水產品品質下降[22]。

圖5 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁總氨基酸含量變化Fig.5 Contents of total amino acids of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

模擬貯運過程中大多數的氨基酸含量都呈下降趨勢,其中酪氨酸、賴氨酸、精氨酸的含量下降最為明顯,這3種氨基酸含量的變化趨勢如圖6、7、8所示。

蝦汁中酪氨酸的初始含量為10.01 mg/g,在經過192 h不同冷鏈條件的貯運后,A1、B1、C1實驗組的酪氨酸含量分別下降至2.06、4.45和2.10 mg/g；精氨酸含量由最初的24.19 mg/g分別降低至12.34、17.61 和12.21 mg/g；賴氨酸含量則由19.44 mg/g分別下降至14.05、12.54 和12.69 mg/g。對照組中蝦汁的酪氨酸、精氨酸和賴氨酸的含量均無明顯變化,且精氨酸、酪氨酸含量的變化與腐敗希瓦氏菌菌落數的變化具有一定相關性,因此推斷蝦汁中氨基酸含量的下降主要由腐敗希瓦氏菌生長和代謝活動引起的。C1組氨基酸變化與A1組差異較小,而與B1組差異顯著,說明溫度波動可導致腐敗希瓦氏菌對這3種氨基酸的需求量提高,從而促進相關氨基酸的降解。

圖6 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁酪氨酸含量變化Fig.6 Tyrosine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics process

圖7 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁精氨酸含量變化Fig.7 Arginine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

圖8 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁賴氨酸含量變化Fig.8 Lysine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.5 生物胺含量變化

微生物的脫羧酶能夠將水產品中的氨基酸脫羧生成生物胺類物質[23-24]。這類反應過程能幫助微生物獲得能量或者抵御不良環境[25]。生物胺的累積不僅會導致水產品的品質劣變,過量攝入如組胺、酪胺、五羥色胺等生物胺,還可能導致食物中毒[26]。通過檢測發現接種腐敗希瓦氏菌的蝦汁中生物胺類物質主要為腐胺和尸胺,與本課題組前期研究[17,27]結果相一致,其變化如圖9、10所示。凡納濱對蝦汁內最初的腐胺含量為3.48 mg/kg,A1、C1組在24和48 h時腐胺的含量已經分別上升至179.81和150.77 mg/kg,而B1組的蝦汁在96 h時腐胺的含量僅為53.26 mg/kg。不同模擬冷鏈流通條件下的接菌組蝦汁中腐胺含量不斷上升,A1、B1、C1的腐胺含量在192 h時分別達到310.78、142.56 和327.32 mg/kg,而3個溫度波動條件下的對照組A2、B2、C2蝦汁中腐胺含量變化不大,說明腐胺的生成主要是由腐敗希瓦氏菌代謝產生。貯運初期的溫度波動導致腐胺的累積快速增加并在中后期不再受降溫的影響。食品中的腐胺可以由精氨酸代謝產生[28],與本研究中腐胺含量的升高和精氨酸含量的下降趨勢相一致。

圖9 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁腐胺含量變化Fig.9 Putrescine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

如圖10所示,A1、B1、C1組蝦汁中尸胺含量不斷上升,且在開始的24 h內A1組的尸胺含量由起始的2.21 mg/kg快速上升至58.07 mg/kg,在48 h內,C1組的尸胺含量上升至40.77 mg/kg,說明相對較高的環境溫度以及存在溫度波動的環境有利于蝦汁中尸胺的產生和累積。同時,在貨架期終點即第192 h時,C1組中的尸胺含量已經超過了A1組,為123.17 mg/kg,說明溫度波動對尸胺含量的增加有較大影響。而空白對照組的A2、B2、C2中尸胺的含量基本穩定,表明尸胺含量的增加主要由腐敗希瓦氏菌代謝產生。與腐胺不同的是,尸胺的前體化合物是賴氨酸[29]。

圖10 不同冷鏈流通過程中凡納濱對蝦汁尸胺含量變化Fig.10 Changes in cadaverine contents of Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

2.6 腐敗希瓦氏菌致腐敗能力分析

腐敗代謝產物產量因子在數值上等于單位數量腐敗菌產生的腐敗代謝產物的量,可作為衡量腐敗菌致腐敗能力的依據[15,30]。如表1所示,A1和C1組蝦汁中貯運末期腐敗希瓦氏菌TVB-N產量因子和尸胺產量因子均明顯大于B1組,說明在外界較高溫度以及溫度波動條件下腐敗希瓦氏菌的致腐敗能力比在4 ℃恒溫條件下強。同時,C1組在貨架期終點時的菌落總數為1.26×109CFU/g,明顯低于A1組,但C1組蝦汁中的腐敗希瓦氏菌TVB-N產量因子(YTVB-N/CFU)的數值約為A1、B1組的2～3倍,尸胺產量因子(Y尸胺/CFU)約為A1、B1組的3倍。C1組貯藏末期的腐胺產量因子(Y腐胺/CFU)也高于B1和A1組,說明與較高溫度條件相比,外界環境的溫度波動更能促進腐敗希瓦氏菌產生腐敗代謝產物。

表1 不同冷鏈流通過程中接菌凡納濱對蝦汁的致腐因子比較Table 1 Yield factors in TVB-N,putrescine and cadaverine contents of inoculated Pacific white shrimp juice at different cold chain logistics

3 結 論

通過分析腐敗希瓦氏菌在3種不同模擬冷鏈流通條件下的凡納濱對蝦蝦汁中微生物生長、腐敗產物產量及氨基酸含量變化等,研究了腐敗菌的生長和代謝活動,發現溫度波動會加速流通初期腐敗希瓦氏菌的生長繁殖,加速蛋白質的水解,導致TVB-N、腐胺、尸胺含量不斷增加,且后期恢復低溫也不能有效抑制微生物生長和腐敗產物的累積,這可能是溫度波動間接導致水產品品質劣變的原因。因此,水產品在冷鏈流通過程中尤其是貯運初期應盡可能避免溫度波動出現“斷鏈”現象。