大腸桿菌O157∶H7噬菌體EC-p9的內溶酶和穿孔素的特性預測及克隆表達

解天慧,石慧

(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)

大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌中最典型的一種食源性致病菌,因產生志賀毒素從而引起腹瀉、出血性結腸炎、溶血性尿毒綜合癥等疾病,嚴重時有可能導致死亡[1-2]。但用抗生素控制大腸桿菌O157∶H7存在爭議,因為抗生素可能導致志賀毒素被大量釋放[3]。臨床實驗表明,抗生素治療可能增加溶血性尿毒綜合癥的風險[3-4]。另外,抗生素的濫用致使耐藥性大腸桿菌O157的數量增加[3,5]。因此,尋找新型的抗菌物質刻不容緩。

近幾年,噬菌體作為一種新型的抑菌劑開始被大量研究,食源性致病菌的噬菌體被分離,并應用于醫療、食品等多個領域[3,6-7]。但噬菌體作為活體病毒,不易保存且不易被人們接受,而具有抑菌作用的內溶酶和穿孔素能很好地解決這些問題[8]。穿孔素和內溶酶在噬菌體裂解細菌中發揮著重要的作用,“穿孔素-內溶酶”裂解體系是dsDNA噬菌體經典的裂解系統[9-10]。內溶酶是一種由dsDNA噬菌體編碼的酶,可降解細菌的肽聚糖并導致細菌死亡[8,11]。高效、抑菌譜寬、不容易產生耐藥性等優點使內溶酶開始應用于醫療、食品安全、病原菌檢測等各個方面[8,11-12]。穿孔素是一種含有跨膜結構的疏水蛋白。在噬菌體裂解細菌過程中,通過在細胞膜上形成孔徑,協助內溶酶與肽聚糖接觸[13]。

本實驗分離得到1株大腸桿菌O157∶H7噬菌體EC-p9，通過十聚體寡核苷酸隨機引物PCR擴增對該噬菌體進行初步鑒定,并通過生物信息學對該噬菌體的內溶酶和穿孔素的生理特征及跨膜結構等進行預測。最后,用大腸桿菌表達體系獲得內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

噬菌體為本實驗室分離保存的烈性大腸桿菌O157∶H7噬菌體EC-p9。感受態大腸桿菌Trans1-T1、BL21(DE3)和載體pEasy-Blunt E1，北京全式金生物有限公司。

1.1.2 試劑與培養基

LB肉湯和TSA培養基,青島海博生物技術有限公司；氨芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside IPTG)、咪唑、SDS-PAGE凝膠試劑盒,索萊寶生物技術有限公司；Ni-IDA填料、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、蛋白和DNA Marker,PCR擴增所用的酶和試劑,北京全式金生物有限公司；噬菌體DNA提取試劑盒,艾德萊生物有限公司；本研究所用DNA引物的合成和PCR產物的測序均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成,DNA引物見表1。其他試劑均為國產分析純。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 噬菌體的初步鑒定

用試劑盒提取噬菌體EC-p9的DNA,以此為模板,用引物208、228、242、270、272、275、277和287進行PCR擴增。PCR擴增條件如下：在94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min,34 ℃復性1 min,72 ℃延伸2 min,共45個循環；最后72 ℃延伸10 min。根據擴增結果,選擇條帶少且亮PCR產物進行再次擴增,將產物膠回收后進行TA克隆并測序。通過國際生物技術信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行相似性比對，確定噬菌體的種類。根據相似度最高的噬菌體內溶酶和穿孔素的基因設計噬菌體EC-p9的內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 2的引物。以噬菌體EC-p9的DNA為模板,Lys 9-F和Lys 9-R(Hol 9-F和Hol 9-R)為引物進行PCR擴增。擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s,55 ℃復性30 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。檢測PCR產物并送往上海生工測序。

1.2.2 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9特性預測

利用NCBI提供的局域相似性比對工具(BLAST)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行相似性分析。分別利用ExPASy ProtParamtool (https://web.expasy.org/protparam/)、SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對內溶素和穿孔素的理化特征、二級結構和跨膜結構進行預測。

1.2.3 質粒pEASY-Lys 9和pEASY-Hol 9的構建與轉化

按1∶7的摩爾質量比分別加入質粒pEasy-Blunt E1和內溶酶Lys 9或穿孔素Hol 9的基因,25 ℃反應5 min。然后加入50 μL Trans1-T1感受態細胞(剛解凍轉化效果最好)混勻,冰浴30 min后,42 ℃水浴30 s,立刻置于冰中2 min。加入250 μL LB肉湯,在200 r/min、37 ℃的條件下培養1 h。將8 μL 500 mmol/L IPTG和40 μL 20 g/L X-gal混合均勻。并涂布在TSA平板(含100 g/L Amp+)上,37 ℃放置30 min后,取200 μL菌液涂布到平板上37 ℃過夜培養。隨機挑取白色的單克隆進行菌落PCR、引物為載體pEasy-Blunt E1中配套的T7 promoter primer和目的基因的下游引物(Lys 9-R或Hol 9-R)。將驗證正確的單克隆經搖瓶培養后提取質粒送到上海生工測序。將測序正確的質粒轉到大腸桿菌BL21(DE3)。

1.2.4 內溶酶Lys 9的最佳誘導時間和誘導劑濃度

1.2.4.1 最佳誘導時間

挑取含有pEASY-Lys 9的BL21(DE3)到5 mL LB(含100 g/L Amp+)中,37 ℃,120 r/min培養16 h。按1%的接種量接種到100 mL的LB(含100 g/L Amp+),于37 ℃,200 r/min培養2～3 h(OD600為0.4～0.6)。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,在37 ℃、200 r/min的條件下誘導蛋白表達。誘導過程中每隔1 h取1 mL細菌樣本,共8 h。取樣后,迅速在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心1 min。去除上清液,用36 μL無菌ddH2O重懸,加入4 μL的4×SDS-PAGE Loading Buffer混勻并煮沸3～5 min。待所有樣本制備完成后進行SDS-PAGE電泳,從而檢測不同誘導時間對內溶酶Lys 9表達的影響。

1.2.4.2 最佳IPTG誘導濃度

在OD600為0.4～0.6含有pEASY-Lys 9的BL21(DE3)中,分別加入終濃度為0.1、0.5、1、2、5 mmol/L的IPTG,并在 37 ℃,200 r/min的條件下振動培養5 h。每個濃度取1 mL細菌樣本,按1.2.3.1小節的方法制備SDS-PAGE電泳上樣液,并進行SDS-PAGE電泳,從而檢測不同濃度的誘導劑對內溶酶Lys 9表達的影響。

1.2.5 穿孔素Hol 9的誘導表達

1.2.5.1 穿孔素Hol 9表達對大腸桿菌BL21(DE3)的作用

挑取含有pEASY-Hol 9的BL21(DE3)到5 mL的LB(含100 g/L Amp+)中,37 ℃,120 r/min培養16 h。按1%的接種量接種到100 mL的LB(含100 g/L Amp+),37 ℃培養5 h(OD600為0.4～0.6),加入終濃度為1 mmol/L的IPTG。在 37 ℃,200 r/min的條件下振動培養。在誘導過程中每隔20 min取菌液樣品,并測定菌液OD600值,共測定2 h。根據細菌生長曲線的變化趨勢,確定穿孔素Hol 9最佳表達時間并且描述Hol 9表達對細菌生長速度的影響。

在OD600值為0.4～0.6,含有pEASY-Hol 9的BL21(DE3)中,按1.2.3.2小節的方法檢測不同濃度IPTG對穿孔素Hol 9表達的影響。其中誘導時間為30 min,其他條件不變。

1.2.6 重組蛋白的純化

按最佳誘導條件表達內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9,誘導表達的菌液總體積為400 mL。誘導結束后,于8 000 r/min離心10 min,收集細菌沉淀。細菌沉淀用100 mL 無菌Tris-NaCl緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,pH 7.5)重懸,并在冰浴條件下超聲破菌(120 W,工作3 s,間歇10 s,共 10 min)。將超聲破碎后的產物在4 ℃、13 000 r/min下離心1 h,上清液用0.45 μm的濾膜過濾。將5 mL Ni-NTA填料裝入柱子中,用25 mL Tris-NaCl緩沖液平衡柱子；將過濾后的上清液加入柱子,填料重懸,上清液自然流出并收集穿透液。再用25 mL Tris-NaCl緩沖液清洗柱子并收集洗滌液后,分別用50 mL 20 mmol/L和50 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白,并收集洗脫液。分別用10 mL 200 mmol/L和500 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白。將純化好的目的蛋白用0.22 μm的濾膜過濾后加入20%的甘油,保存于-20 ℃,并進行SDS-PAGE檢測。用微量紫外分光光度計檢測蛋白濃度。

2 實驗結果

2.1 噬菌體的初步鑒定

如圖1-b所示,用引物270擴增PCR產物的條帶少且亮,將產物再次進行PCR擴增，產物如圖1-c所示。最終回收到一段700～800 bp的DNA片段,克隆測序并將序列通過Blasts工具對比,結果顯示,噬菌體EC-p9與大腸桿菌噬菌體PE37相識度最高為81.20%。根據Escherichia phage PE37內溶酶和穿孔素的核苷酸序列設計引物,調取噬菌體EC-p9的內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的核苷酸序列,獲得長度分別為800和700 bp左右的PCR產物,見圖1-d。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測噬菌體EC-p9的DNA(a)、噬菌體的隨機引物擴增的PCR產物(b)、引物270的在擴增后的PCR產物(c)和噬菌體內溶酶和穿孔素的PCR產物(d)Fig.1 EC-p9 DNA (a),PCR products of random primer amplification of phage (b),PCR products by 270 primer (c) and PCR products of Lys 9 and Hol 9 (d) by agarose gel electrophoresis注：M為marker;圖a中,1和2為DNA。圖b中,1、2、3、4、5、6、7和8分別為引物208、228、241、270、272、275、277和287的產物;圖c中,1為引物270的PCR再擴增產物;圖d中,1和2分別穿孔素Hol 9 和內溶酶Lys 9的基因片段

2.2 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的特性預測

2.2.1 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的理化性質和二級結構預測

利用ExPASy Prot Paramtool預測內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的特性,如表2所示。利用SOPMA內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的二級結構,內溶酶Lys 9的α-螺旋、β-折疊、延長鏈、β-轉角和無規則卷曲分別占氨基酸總數的54.62%、0%、9.62%、8.85%和36.92%。穿孔素Hol 9的α-螺旋、β-折疊、延長鏈、β-轉角和無規則卷曲分別占氨基酸總數的44.44%、0%、13.43%、5.09%和37.04%。

表2 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的理化性質Table 2 The physicochemical properties of endolysin Lys9 and holin Hol 9

2.2.2 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的結構域預測

式中:為載體坐標系(B系)至地理坐標系(L系)的坐標轉換矩陣;fB為比力;為地固坐標系(E系)相對于慣性坐標系(i系)的角速度轉換到L系上的角速度向量的反對稱矩陣;為L系相對于B系的旋轉角速度向量的反對稱矩陣;gL為當地水平坐標系里重力向量。

利用Pfam數據庫檢索,對內溶酶Lys 9和穿孔素的Hol 9的結構域進行預測,見圖2。結果表明,內溶酶Lys 9具有2個保守的結構域,其中1個為N端酶活結構域,屬于Muraidase家族,能裂解β-1,4-糖苷鍵,是N-乙酰胞壁酸酶；另1個為肽聚糖結合域,屬于PG_binding_1家族。穿孔素Hol 9含有1個保守的結構域,屬于Bacteriophage T holin家族,能破壞細胞,并傳遞信息來控制細胞的裂解時間。

圖2 內溶酶Lys 9(a)和穿孔素Hol 9(b)的結構域Fig.2 The structural domain of endolysin Lys 9 (a) and holin Hol 9 (b)

2.2.3 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的跨膜結構預測

利用TMHMM Server v.2.0對內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的跨膜結構進行預測,見圖3。結果顯示,內溶酶Lys 9沒有跨膜結構；穿孔素Hol 9在N端1～26位氨基酸處于胞內,47～126位氨基酸處于胞外,在27～46位氨基酸形成一個跨膜結構。

2.3 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9質粒的構建

按照1.2.2小節的方法構建重組表達質粒pEASY-Lys 9和pEASY-Hol 9,用菌落PCR驗證重組質粒pEASY-Lys 9和pEASY-Hol 9。結果如圖4所示,PCR產物在700 bp(泳道6)和800 bp(泳道7、8和9)左右有明顯的條帶,這與穿孔素和內溶酶的基因大小一致,表明獲得了表達方向正確的重組表達質粒。

圖3 內溶酶Lys 9的跨膜結構(a)和穿孔素Hol 9的跨膜結構(b)Fig.3 Transmembrane structure of endolysin Lys 9 (a) and holin Hol 9 (b)

圖4 瓊脂糖凝膠電泳分析質粒(a)和菌落PCR產物(b)Fig.4 Plasmid (a) and PCR products of colony (b) by agarose gel electrophoresis注：M為marker;圖a中,1和2分別為pEASY-Hol 9和pEASY-Lys 9;圖b中,1-6為穿孔素的白色單克隆的菌落PCR產物,7-10為內溶酶的白色單克隆的菌落PCR產物

2.4 內溶酶Lys 9的表達和純化

2.4.1 內溶酶Lys 9最佳誘導條件的確定

內溶酶Lys 9在表達感受態細胞BL21(DE3)中大量表達,在30 kDa左右出現明顯條帶,與預測的內溶酶Lys 9的分子質量一致。不含重組蛋白基因的空質粒經誘導培養后無法檢測到相應的蛋白,因此內溶酶在含有pEASY-Lys 9質粒的BL21(DE3)成功表達。由圖5-a可見,內溶酶的表達量隨著誘導時間的延長而逐漸增加,在誘導5 h后表達量到達峰值,因此最佳誘導時間為5 h。由圖5-b可見,當IPTG的濃度在1和2 mmol/L時表達量最大,出于經濟方面的考慮將最佳誘導濃度定為1 mmol/L。

圖5 不同誘導時間(a)和IPTG濃度(b)對Lys 9表達量的影響Fig.5 Effect of different induced time (a) and IPTG concentration (b) on the amount of expression of Lys 9注：M為marker;圖a中:1-9分別代表誘導時間0 h到8 h,其中時間間隔為1 h;圖b中,1-5分別代表濃度為0.1、0.5、1、2、5 mmol/L的IPTG誘導,6為不含內溶酶Lys 9的空質粒

2.4.2 內溶酶Lys 9的純化

采用超聲破碎法破碎重組大腸桿菌BL21(DE3),將獲得的沉淀、上清液和鎳柱純化收集的所有液體進行SDS-PAGE電泳。如圖6所示,內溶酶Lys 9主要以可溶性蛋白的形式存在上清液中,且在33 kDa到26 kDa左右出現明顯條帶,目的蛋白被200 mmol/L咪唑大量洗脫,洗脫液中不含雜蛋白。

M-marker;1-菌體;2-超聲破菌后的上清液;3-超聲破菌后的沉淀;4-上清液的穿過峰;5-緩沖液洗脫峰;6-9分別為濃度為20、50、200、500 mmol/L的咪唑洗脫液圖6 內溶酶Lys 9的純化Fig.6 The purification of endolysin Lys 9

2.5 穿孔素的Hol 9表達純化

2.5.1 穿孔素Hol 9表達對表達感受態大腸桿菌BL21(DE3)生長抑制分析

將含有pEASY-Hol 9的BL21(DE3)和含有pEASY-Blunt E1的BL21(DE3)在37 ℃、200 r/min的條件下培養5 h后,OD600值分別為0.411和0.626。在此基礎上加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導穿孔素表達。在誘導過程中,通過測定表達感受態細胞BL21(DE3)的濁度來監測穿孔素對表達蛋白的影響,從而確定表達時間,如圖7所示。結果顯示,在加入誘導劑誘導之前,pEASY-Hol 9的BL21(DE3)的OD600值比含有EASY-Blunt E1的BL21(DE3) OD600值低了0.2左右；含有pEASY-Hol 9質粒的BL21(DE3)誘導20 min后,細菌的濃度最大,其OD600值為0.427。之后隨著誘導時間的延長,pEASY-Hol 9質粒的BL21(DE3)的OD600值逐漸降低,在120 min后低至0.280。而含有pEASY-Blunt E1質粒的BL21(DE3)菌液濃度隨著誘導時間的增加而增加。因此,穿孔素Hol 9的最佳表達時間為20 min。

圖7 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的表達對BL21生長的影響Fig.7 Effect of expression of endolysin Lys 9 and holin Hol 9 on growth of BL21

2.5.2 穿孔素Hol 9表達的最佳IPTG濃度和穿孔素的純化

圖8 不同IPTG濃度對穿孔素Hol 9表達量的影響(a)和穿孔素Hol 9的純化(b)Fig.8 Effect of different IPTG concentrations on amount of expression of holin Hol 9 (a) and the purification of holin Hol 9 (b)注：M為marker;圖a中1-5分別代表濃度為0.1、0.5、1、2、5 mmol/L的IPTG誘導,6為不含穿孔素Hol 9的空質粒;圖b中,1為上清液,2為穿過峰,3為洗脫液,4-7分別為濃度為20、50、200、500 mmol/L的咪唑洗脫液

由圖8-a可見,不同濃度的IPTG誘導對穿孔素Hol 9表達量沒有明顯差異,與空質粒相比穿孔素的表達導致了在分子質量為35 kDa處的蛋白缺失。如圖8-b所示,重組蛋白在26 kDa左右出現明顯條帶,用200 mmol/L咪唑洗滌鎳柱時,目的蛋白被大量洗脫,且洗脫液不含雜蛋白。

2.6 內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的濃度測定

利用微量紫外分光光度計對純化的內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9的質量濃度進行測定,內溶酶Lys 9溶液的質量濃度為2.49 g/L；穿孔素Hol 9溶液的質量濃度為0.95 g/L。

3 討論

大腸桿菌O157∶H7是一種嚴重危害公共衛生安全的食源性致病菌,能在食品加工和貯藏中的相關脅迫誘導下發生交叉適應,使細菌在后續殺菌或抑菌處理中得以存活[15]。耐藥性大腸桿菌的出現也增加了人類大腸桿菌的風險。噬菌體內溶酶和穿孔素作為新型抑菌物質能用于控制對人體健康造成威脅的病原菌。本研究中,對篩選的噬菌體EC-p9進行了初步鑒定,發現其與大腸桿菌噬菌體PE37 tRNA簇的相識最高為81.20%。根據NCBI提供的信息可知,噬菌體PE37屬于dsDNA肌尾科噬菌體。因而,噬菌體EC-p9可能是dsDNA肌尾科噬菌體,其裂解體系為“穿孔素-內溶酶”。“穿孔素-內溶酶”裂解體系是dsDNA噬菌體的經典的裂解系統,如λ和 T4 等[16]。

穿孔素和內溶酶作為廣譜抑菌劑,在控制食源性致病菌中表現出巨大的潛力。YU等[12]和SONG等[17]分別研究了內溶酶LysSAP8和穿孔素GH15對金黃色葡萄球菌抑制能力。本研究利用生物信息學分析了EC-p9的內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9。革蘭氏陰性菌噬菌體的內溶酶通常為球形結構,并且缺乏細胞結合域[18-20]。但噬菌體EC-p9的內溶酶Lys 9具備兩個結構域,其催化活性結構域屬于N-乙酰胞壁酸酶,能裂解β-1,4-糖苷鍵；另外,還具有一個肽聚糖結合域。穿孔素Hol 9是典型Ⅲ型穿孔素[21],只有一個跨膜結構,N端在胞內,C端在胞內,主要作用是破壞細胞膜,傳遞信息,控制噬菌體裂解細菌的時間。

本研究利用大腸桿菌表達體系獲得內溶酶Lys 9和穿孔素Hol 9。內溶酶Lys 9的最佳表達條件是在37 ℃、1 mmol/L IPTG誘導表達5 h。在該條件下,利用鎳柱純化獲得為2.49 mg/mL的內溶酶Lys 9溶液。但穿孔素Hol 9的表達對大腸桿菌BL21(DE3)具有毒害作用[18,21]。在加入IPTG誘導表達前,含有pEASY-Hol 9的大腸桿菌BL21(DE3)的生長速度比含有空質粒和pEASY-Lys 9的BL21(DE3)的生長速度慢。這可能是穿孔素Hol 9在不含誘導劑的情況下少量表達,導致BL21(DE3)裂解死亡。在IPTG表達20 min后菌液濃度達到最高點,因此穿孔素Hol 9的最佳表達時間是20 min。且不同濃度的IPTG對穿孔素Hol 9的表達量沒有影響。利用鎳柱純化穿孔素Hol 9獲得質量濃度為0.95 mg/mL的穿孔素Hol 9溶液。

總之,本研究利用隨機引物初步鑒定了噬菌體EC-p9,并利用生物信息學分析該噬菌體的內溶酶和穿孔素,并成功表達了噬菌體EC-p9的內溶酶和穿孔素。該研究為后續內溶酶和穿孔素的抑菌特性的研究以及噬菌體EC-p9的裂解機制的研究奠定了基礎。