以巧克力為載體的益生菌膳食補充劑的開發

馬申嫣,王晶,趙巖,曹江,翟齊嘯,張灝,趙建新,田豐偉,陳衛

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

低聚半乳糖是一類重要的膳食益生元,作為腸道有益菌的發酵底物,可以抑制有害菌增殖,促進腸道內乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的生長繁殖,使有益菌處于優勢狀態[1]。膳食補充低聚半乳糖已被證明可以排除體內毒素,減輕肝臟負擔,提高機體免疫力,從而緩解重金屬鉛對機體的損害[2]。張家超等的研究發現小鼠攝入植物乳桿菌的同時外源補充低聚半乳糖可以減少益生菌導致的腸道菌群適應性突變,從而改善腸道菌群的整體穩定性[3]。因此,益生元和益生菌的聯用可能更有利于維護宿主健康[4]。在前期實驗中,江南大學食品生物技術中心篩選到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM8661已被證明可有效降低機體鉛蓄積并緩解鉛暴露造成的氧化應激損傷,對機體具有較好的保護效果[5-6]。然而,L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖復配的膳食補充劑的開發仍存在空白。

目前,市場上的益生菌膳食補充劑形式主要為粉劑、片劑和膠囊等,產品種類單一,且在經胃腸等消化系統后益生菌存活率低,功效減弱[7-8]。因此,益生菌膳食補充劑的活菌數與儲藏時間及成分之間的相互作用是其發揮益生功效的關鍵,也是膳食補充劑產品品質的重要評價指標[9]。研究表明巧克力的水分含量低、油脂含量高,可以使菌體在長時間的保存后仍能保持其生物活性和功能特性,是益生菌膳食補充劑的優良載體[10]。

綜上所述,本研究擬開發一種以巧克力作為載體復合L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖的緩解鉛毒性的膳食補充劑,探究巧克力制作過程中益生菌加入溫度、攪拌時間、結晶溫度、結晶時間以及回溫時間對巧克力品質的影響，并對其儲藏特性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可可液塊和可可脂,無錫上可食品有限公司；脫脂奶粉,內蒙古伊利實業集團股份有限公司；大豆卵磷脂,上海善優生物科技有限公司；MRS培養基,中國國藥化學試劑公司；低聚半乳糖,百思特天驕優品。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及制備

將L.plantarumCCFM8661的二級純化培養液以2%的接種量接種于MRS液體培養基中,37 ℃培養18 h。培養物經離心(4 ℃、5 000×g)后去上清液,洗滌后,菌體沉淀用10%的脫脂乳重懸后冷凍干燥。凍干菌粉(活菌數1012CFU/g)保藏于-20 ℃備用。

1.2.2 以巧克力為載體的膳食補充劑的制作流程

以巧克力為載體的膳食補充劑由28%可可液塊、40%白砂糖、16%脫脂奶粉、15%可可脂和0.3%大豆卵磷脂組成(以上含量均為質量百分比)[11]。將稱取的可可液塊及可可脂在40 ℃下熔化后[12],加入白砂糖、脫脂奶粉,混合均勻后制得巧克力漿,將巧克力勻漿置于60 ℃的環境下,精煉36 h[13]。在精煉結束前,將大豆卵磷脂加入其中,并繼續混合30 min。精煉結束后,在一定溫度下將L.plantarumCCFM8661凍干菌粉(108CFU/g巧克力)及低聚半乳糖(6 g/100 g巧克力)[14]加入到制備的樣品中,攪拌一定時間后,進行3階段的調溫。第1階段,將物料冷卻至29 ℃；第2階段,從29 ℃冷卻至結晶溫度并結晶一定時間；第3階段,回溫至29～30 ℃[15]。澆注成型后置于8 ℃下冷卻25 min,脫模,包裝后儲存。

1.2.3 以巧克力為載體的膳食補充劑的工藝優化

1.2.3.1 單因素試驗

按照1.2.2小節的方法制作巧克力,設置精煉結束后,設置益生菌接種溫度為32、35、37和40 ℃,攪拌時間為2.5、5、10和15 min,結晶溫度22、24、26、28和30 ℃,結晶時間10、15、20、25和30 min,回溫時間5、10、15、20和25 min,測定巧克力中的活菌數、水分含量及水分活度。

1.2.3.2 正交試驗

以單因素試驗為基礎,設計4因素3水平正交試驗(表1和表2),并測定各組巧克力中的活菌數、水分活度以及水分含量,以確定最佳的工藝優化方案。

表1 正交試驗因素表Table 1 Orthogonal experiment factors and levels

表2 正交試驗設計Table 2 Orthogonal experiment design

1.2.4 巧克力中活菌數、水分活度和水分含量的測定方法

活菌數：稱取20 g巧克力,與180 mL蛋白胨水溶液(0.1%)混合。混合物熔化后(40 ℃,15 min),振蕩均勻進行平板計數[16];水分活度：參考KONAR等[17]的方法;水分含量：使用水分含量儀測定。均為1式3份測量。

1.2.5 以巧克力為載體的膳食補充劑儲藏期的特性研究

根據正交試驗確定的最佳工藝條件,重新制作以巧克力為載體的膳食補充劑,在-20、4和25 ℃的條件下儲存,并在第0、30、60和90天時測定巧克力及復配菌粉對照的活菌數,評價其對模擬胃腸液的耐受能力。

1.2.6 儲藏期巧克力中活菌數和模擬胃腸液的耐受能力的測定

活菌數：按照1.2.4小節的方法。模擬胃腸液的耐受能力：稱取4 g巧克力加入到300 mL模擬胃液(3 g胃蛋白酶/L無菌生理鹽水,pH 3.0)中溶解,取1 mL溶液活菌計數,其余部分在37 ℃培養3 h；然后取1 mL溶液進行活菌計數,同時吸取9 mL溶液離心棄上清液,用9 mL模擬腸液(1 g/L胰蛋白酶和3 g/L膽鹽)重懸,37 ℃培養4 h,耐受腸液結束后取1 mL活菌計數,并計算菌體存活率[18]。

1.2.7 巧克力的感官評定方法

參考DESHPANDE等[19]的感官評定方法。評定在相對安靜衛生的獨立空間內進行,評定小組人數為8人,評分標準如表3所示。評分以8個人評分的平均值表示。

表3 巧克力感官評分標準Table 3 Standard for sensory evaluation of chocolate

1.2.8 數據處理及結果分析

實驗數據應用SPSS 19.0進行統計分析,結合GraphPad Prism 6作圖,所有數據均以“平均值±標準差”表示,每項實驗至少3次平行重復,通過單因素方差分析(ANOVA)和Duncan事后檢驗進行分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試實驗結果

2.1.1 益生菌接種溫度的影響

實驗結果表明,接種溫度略有提高利于保持益生菌的存活率,但溫度過高會使益生菌存活率下降(圖1-a)。37 ℃時,巧克力樣品中的活菌數最高,且水分活度及水分含量顯著最低(圖1-b和圖1-c)。因此,最佳接種溫度選擇為37 ℃。

a-巧克力中的活菌數；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖1 益生菌接種溫度對巧克力中活菌數、水分活度和水分含量的影響Fig.1 Effects of inoculation temperature on viable count,water activity and moisture content in chocolate注:柱形圖上的a～c表示不同組之間的顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.1.2 攪拌時間的影響

如圖2所示,隨著攪拌時間增加,巧克力中的活菌數先上升后下降,而水分含量與水分活度則表現出相反的趨勢。較于其他攪拌時間,攪拌10 min時,巧克力中的活菌數顯著提高,且樣品中水分活度和水分含量顯著降低,因此最佳攪拌時間確定為10 min。

a-巧克力中的活菌數；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖2 攪拌時間對巧克力中的活菌數、水分活度和水分含量的影響Fig.2 Effects of stirring time on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.1.3 結晶溫度的影響

如圖3所示,當結晶溫度為26 ℃時,活菌數最高(1.58×1010CFU/g)。此外,隨著結晶溫度升高,巧克力漿形成大量結晶,水分活度和水分含量下降。因此,結晶溫度定為26 ℃。

a-巧克力中的活菌數；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖3 結晶溫度對巧克力中的活菌數、水分活度和水分含量的影響Fig.3 Effects of crystallization temperature on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.1.4 結晶時間的影響

如圖4所示,隨著結晶時間的增加,巧克力的水分活度和水分含量表現出先下降后升高的趨勢。因此,結晶時間確定為20 min。

a-巧克力中的活菌數；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖4 結晶時間對巧克力中的活菌數、水分活度和水分含量的影響Fig.4 Effects of crystallization time on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.1.5 回溫時間的影響

如圖5所示,回溫10 min時巧克力樣品的活菌數最高,并伴隨著最低水平的水分活度和水分含量。因此,回溫時間應挑選10 min最為適宜。

a-巧克力中的活菌數；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖5 回溫時間對巧克力中的活菌數、水分活度和水分含量的影響Fig.5 Effects of rewarming time on viable count,water activity and moisture content in chocolate

2.2 正交試驗

在9個正交實驗組中,第2組和第9組的巧克力樣品的活菌數較高,其中第2組最高。水分活度較低組為第1組、第2組和第9組巧克力樣品,其中第2組最低。同時第2組、第5組、第7組和第9組的水分含量最低(圖6)。綜合以上研究結果,并把巧克力的活菌數和水分活度作為主要評價指標,第2組巧克力品質為最佳條件,即巧克力制作過程中在35 ℃接入L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖,攪拌10 min,26 ℃下結晶,最后回溫10 min。

a-巧克力中的活菌數；b-巧克力的水分活度；c-巧克力的水分含量圖6 不同正交實驗組巧克力中的活菌數、水分活度和水分含量Fig.6 Viable count,water activity and moisture content of chocolate in different orthogonal experimental groups

2.3 以巧克力為載體的益生菌膳食補充劑的儲藏特性

2.3.1 儲存期間巧克力活菌數的變化

如圖7所示,儲存時間和溫度的上升均會導致巧克力產品中活菌數下降。此外當儲藏溫度和時間一致時,巧克力產品中的活菌數顯著高于菌粉對照組。這表明巧克力包裹可以明顯提高益生菌在儲藏期間的活菌數,并且儲藏溫度越低,時間越短活菌數越高。

圖7 儲藏期間巧克力中L.plantarum CCFM8661活菌數的變化Fig.7 Changes of viable counts of L.plantarum CCFM8661 in chocolate during storage

2.3.2 儲存期間巧克力益生菌對模擬胃腸液的耐受能力

模擬胃腸液中培養7 h后,以巧克力為載體的膳食補充劑中的活菌數明顯高于菌粉(表4)。巧克力作為載體可以保護益生菌在經過模擬胃液和腸液后仍保持較高存活率[20-21]。

表4 巧克力及菌粉中益生菌對模擬胃腸液的耐受能力Table 4 Tolerance of probiotics to simulated gastrointestinal fluids in chocolate and powder

2.3.3 巧克力的感官評價

感官評價結果表明包埋益生菌復合膳食補充劑對巧克力的形態、雜質色香味以及組織形態并無顯著影響(表5)。這可能是由于益生菌被巧克力均勻包裹后,菌體處于休眠狀態。此外,感官結果顯示,添加低聚半乳糖不會影響巧克力的感官品質,與前人的結論一致[22]。

表5 巧克力的感官評定Table 5 The sensory evaluation of the chocolate

3 結論

本研究通過單因素試驗和正交試驗探究以巧克力作為載體的復合L.plantarumCCFM8661和低聚半乳糖膳食補充劑的最佳工藝條件。研究發現,以巧克力為載體的復合膳食補充劑制作的最佳工藝條件為益生菌加入溫度35 ℃、攪拌時間10 min,結晶溫度26 ℃,回溫時間10 min。與復配菌粉相比,以巧克力為載體的復合膳食補充劑的貨架期更長,其最佳儲藏溫度為-20 ℃。同時,巧克力包埋的益生菌比未包埋的益生菌具有更強的耐酸耐膽鹽能力,且包埋益生菌膳食補充劑并不會影響巧克力的感官品質。