一步法快速?gòu)拿撝狗壑腥喾蛛x脂肪氧合酶

蔡燕,田丹,嚴(yán)鑫,李百裕,李宇杰,于麗娟,吳錦明*

1(南通大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,江蘇 南通,226019)2(南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南通,226019)3(南通職業(yè)大學(xué) 藥品與環(huán)境工程學(xué)院,江蘇 南通,226007)

脂肪氧合酶(lipoxygenases,LOXs)屬于結(jié)構(gòu)相關(guān)的非血紅素鐵雙加氧酶家族,廣泛分布于動(dòng)植物界。它能催化含一個(gè)或多個(gè)(1Z,4Z)-戊二烯結(jié)構(gòu)的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA),如亞油酸、花生四烯酸的氫發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，PUFA的氧化作用是形成具有多種生物功能的活性脂類的過(guò)程[1]。LOXs底物特異性廣泛,可利用性高,已在食品、紡織、造紙等眾多生物技術(shù)領(lǐng)域被商業(yè)化開發(fā)應(yīng)用[2-6]。近年來(lái),利用硫酸銨沉淀法、柱層析法、制備電泳法等傳統(tǒng)方法對(duì)不同來(lái)源的LOXs進(jìn)行純化和表征的研究報(bào)道較多，然而這些分離技術(shù)大多成本高并且耗時(shí)長(zhǎng),很難規(guī)模化應(yīng)用[4,7-9]。商品化的 LOXs主要通過(guò)大豆粉浸提后結(jié)合柱層析法獲得,價(jià)格較為昂貴。

三相分離技術(shù)(three phase partitioning,TPP)是近年發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)單、高效的非色譜技術(shù),主要用于從粗原料或發(fā)酵液中分離和濃縮蛋白質(zhì)。TPP法是指在粗提物中加入硫酸銨(鹽)和叔丁醇(有機(jī)溶劑),以使目的蛋白在界面相沉淀,而雜質(zhì)主要分配在叔丁醇(頂相)和水相(底相)中[10]。這種技術(shù)因易于操作、可規(guī)模化和成本低而頗受關(guān)注。已有報(bào)道稱,TPP法是過(guò)氧化物酶[11-14]、蛋白酶[15-16]、黃瓜素[17]、多酚氧化酶[18-19]、血清肽酶[20]、漆酶[21]、過(guò)氧化氫酶[22]等多種酶的有效提取和純化技術(shù),但尚未見應(yīng)用TPP法一步純化大豆粉中LOXs的相關(guān)報(bào)道。

本文利用TPP技術(shù)建立了一種有效的純化LOXs的方法。所有的TPP實(shí)驗(yàn)都是用脫脂豆粉中提取的粗LOXs酶液進(jìn)行的，目的是利用TPP法從脫脂大豆粉中分離、濃縮LOXs并達(dá)到最大的純度和提取率。實(shí)驗(yàn)中考察了硫酸銨飽和度、粗酶液與叔丁醇的比例、溫度和pH值等工藝參數(shù)對(duì)提取效率的影響。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析法對(duì)得到的LOXs酶的純度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆, 2019年產(chǎn)于黑龍江；亞油酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、考馬斯亮藍(lán)G-250,Sigma公司；(NH4)2SO4、叔丁醇、吐溫-20、甲醇等,德國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LD4-2型離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司；CG001機(jī)械干磨機(jī),廣東德爾有限公司；PHS-3B精密PH計(jì),上海雷磁儀器廠；Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡,德國(guó)蔡司公司；XH-D快速混勻器,無(wú)錫市萊浦儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂氧酶粗提物的制備

用蒸餾水清洗大豆,于干凈的托盤中干燥。稱取約10 g大豆,物理去皮后,用石油醚脫脂直到溶劑不變色。然后將脫脂大豆粉碎成小塊,過(guò)50目篩網(wǎng)進(jìn)行篩分。

用100 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7)將脫脂豆粉攪拌浸泡混合1 h后,4 000 r/min離心20 min,收集所得上清液用于進(jìn)一步的TPP純化研究。

1.3.2 脂氧酶的三相分離

在設(shè)定的溫度下,渦流條件下用適量的(NH4)2SO4將LOXs粗提液飽和,注意盡量避免起泡。待(NH4)2SO4完全溶解后,逐滴加入適量的叔丁醇。然后將混合物徹底渦流混合,并靜置60 min。在4 000 r/min條件下低速離心10 min,實(shí)現(xiàn)3種不同相(上部有機(jī)相、中間界面沉淀相和底層水相)的完全相分離。收集含LOXs的中間界面蛋白沉淀,并溶解在2 mL 2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 9.0)中,進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)含量和酶活性,計(jì)算純化倍數(shù)和活性回收率。

以初加粗提液的活性為100%，分析了包括(NH4)2SO4飽和度(20%～70%)、LOXs粗提液樣品與叔丁醇的體積比(1∶1～1∶4)、溫度(0～40 ℃)和pH (5～10)在內(nèi)的各工藝參數(shù)對(duì)LOXs分離效果的影響。

1.3.3 脂氧酶活性的測(cè)定

LOXs的活性測(cè)定是通過(guò)234 nm處吸光度的增加來(lái)監(jiān)測(cè)的[23]。在恒溫25 ℃下,量取0.2 mL脂氧酶酶液加入至1.5 mL的底物亞油酸溶液中,靜置3 min后,加入5 mL無(wú)水乙醇使反應(yīng)結(jié)束,然后加入5 mL的蒸餾水,充分搖勻后,在234 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度。空白實(shí)驗(yàn)是在酶液中先加5 mL無(wú)水乙醇滅活,再加1.5 mL底物溶液靜置3 min,最后加入5 mL的蒸餾水。脂氧合酶的一個(gè)單位被定義為在總體積為3 mL的情況下,1 min內(nèi)在234 nm處產(chǎn)生0.001光密度的活性。

1.3.4 蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定

用Bradford法測(cè)定蛋白濃度[24],標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析處理

所有實(shí)驗(yàn)分2次進(jìn)行,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。比酶活力、純化倍數(shù)和活力回收率分別按公式(1)、(2)、(3)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

(2)

(3)

1.3.6 掃描電鏡

將粗酶液、三相分離法得到的中間沉淀相進(jìn)行透析處理,真空冷凍干燥24 h,采用高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)蛋白沉淀的形貌和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測(cè)及分析。

1.3.7 SDS-PAGE凝膠電泳分析

對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析,按稍作修改的Laemmli方法進(jìn)行[25]。電泳凝膠由5%的堆積凝膠和12%的分離凝膠組成,其電壓分別為160和200 V。電泳后,用考馬斯亮藍(lán)G-250在體積分?jǐn)?shù)為45.4%甲醇和體積分?jǐn)?shù)為9.2%乙酸的混合溶液中將樣品凝膠染色1 h,然后用體積分?jǐn)?shù)為7.5%乙酸和體積分?jǐn)?shù)為5%甲醇的混合溶液脫色3 h。所用分子質(zhì)量為BioRad低分子質(zhì)量標(biāo)記 (低范圍SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn))。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑類型對(duì)脂氧酶分配的影響

有機(jī)溶劑不僅影響體系的極性和介電常數(shù),而且影響三相的形成和分離。本文測(cè)定了正丁醇、異丙醇、叔丁醇、正戊醇和乙醇這5種有機(jī)溶劑對(duì)脂氧酶分配過(guò)程的影響。其他條件設(shè)定為：鹽飽和度(60%)、粗提液與有機(jī)溶劑的體積比(1∶2)、pH 7,20 ℃下靜置60 min。結(jié)果如圖1所示,與其他溶劑相比,叔丁醇更為有效,脂氧酶的純化倍數(shù)和活力回收率分別為7.2倍和68.8%,可能是因?yàn)槭宥〈伎梢酝ㄟ^(guò)與沉淀蛋白結(jié)合來(lái)增加浮力,從而使其漂浮在密度更高的水鹽層之上。

圖1 有機(jī)溶劑類型對(duì)脂氧酶純化倍數(shù)和活力回收率的影響Fig.1 Effect of organic solvent types on purification and activity recovery of LOXs

此外,由于其較高的分子質(zhì)量,不能滲透到折疊的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中,因此不會(huì)引起分離酶的變性。在20～30 ℃下,還表現(xiàn)出明顯的滲透和擁擠效應(yīng),提高了LOX的分配效率。

2.2 (NH4)2SO4飽和度對(duì)脂氧酶分配的影響

(NH4)2SO4通過(guò)改變TPP過(guò)程中溶液的離子強(qiáng)度而起著重要作用。鹽分飽和度通過(guò)鹽析作用影響蛋白質(zhì)的溶解度,是蛋白質(zhì)沉淀的主要原因。將(NH4)2SO4加入到粗提液中,獲得20%～70%的最終飽和度,并在20 ℃、pH 7、粗提液與叔丁醇的體積比為1∶2的條件下優(yōu)化60 min,以獲得界面沉淀中所需酶的最大量。如圖2所示,增加(NH4)2SO4飽和度可提高LOXs的回收率,在 (NH4)2SO4飽和度為60%時(shí)可獲得最大純度(7.13)和回收率(67.89%)。進(jìn)一步增加(NH4)2SO4飽和度將減少LOXs選擇性分配到中間相中,這可能是由于LOXs酶的不可逆變性。根據(jù)這些結(jié)果,選擇60% (NH4)2SO4飽和度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳條件。

圖2 硫酸銨飽和度對(duì)脂氧酶純化倍數(shù)和活力回收率的影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4 saturation on purification fold and activity recovery of LOXs

2.3 粗酶液與叔丁醇比例對(duì)脂氧酶分配的影響

研究了粗酶液與叔丁醇的體積比在1∶1～1∶4范圍內(nèi)對(duì)脂氧酶分配的影響，結(jié)果如圖3所示。在粗提液與叔丁醇的體積比為1∶2.5時(shí),其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為:(NH4)2SO4達(dá)60%飽和,pH 7、20 ℃下靜置60 min,LOXs的最大純化倍數(shù)和回收率分別達(dá)到7.95%和75.2%。當(dāng)叔丁醇用量在1∶1～1∶2范圍時(shí),其用量越少,則與(NH4)2SO4的協(xié)同作用越弱,萃取效率相應(yīng)越低。相反,如果叔丁醇含量高于1∶2.5,LOXs蛋白的變性更頻繁,LOXs酶的純度和活力回收率降低。因此,選擇粗提物與叔丁醇的比例為1∶2.5,進(jìn)一步考察其他因素對(duì)脂氧酶分配的影響。

圖3 叔丁醇用量對(duì)脂氧酶純化倍數(shù)和活力回收率的影響Fig.3 Effect of broth to t-butanol ratios on purification fold and activity recovery of LOXs

2.4 溫度對(duì)脂氧酶分配的影響

溫度是TPP過(guò)程中的一個(gè)重要參數(shù),影響著酶的結(jié)構(gòu)和整體穩(wěn)定性。在保持(NH4)2SO4飽和度60%、pH 7、粗提液與叔丁醇比例為1∶2.5、萃取時(shí)間為60 min等參數(shù)不變的情況下,通過(guò)在0～40 ℃范圍內(nèi)改變水浴溫度來(lái)研究溫度對(duì)脂氧酶分配的影響。由圖4可知，在20 ℃下,酶的純度隨著溫度的升高而增加,這是因?yàn)闇囟鹊纳呓档土巳軇┑恼扯群兔芏?從而導(dǎo)致傳質(zhì)強(qiáng)化,提高了提取率。在溫度高于20 ℃時(shí)萃取效率的降低可能是由于LOXs酶的熱失活。因此,為保持天然酶結(jié)構(gòu),后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在室溫20 ℃下進(jìn)行。

圖4 溫度對(duì)脂氧酶純化倍數(shù)和活力回收率的影響Fig.4 Effect of temperature on purification fold and activity recovery of LOXs

2.5 pH值對(duì)脂氧酶分配的影響

TPP過(guò)程中的另一個(gè)重要的影響因素是pH值,它能改變氨基酸的電離狀態(tài)。通過(guò)調(diào)節(jié)pH值,蛋白質(zhì)的凈電荷會(huì)改變,體系中酶的分配效率也會(huì)受影響。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持其他實(shí)驗(yàn)條件不變：60%的(NH4)2SO4飽和度,粗酶液與叔丁醇的比例1∶2.5,在25 ℃下保持60 min,考察pH在5～10之間時(shí)LOX分配效率的變化,結(jié)果如圖5所示。隨著pH值從5增加到8,LOXs的純化倍數(shù)和活力回收率增加,這可解釋為L(zhǎng)OXs在pH 8時(shí)對(duì)叔丁醇具有較好的構(gòu)象穩(wěn)定性。在酸性pH下LOXs的回收率較中性范圍低,這可能是因?yàn)樗嵝詐H提供了更多的H+來(lái)競(jìng)爭(zhēng)LOXs和叔丁醇之間的相互作用。TPP提純LOXs在pH 8條件下得到了最大純度(8.2)和活力回收率(78.2%)。

圖5 pH對(duì)脂氧酶純化倍數(shù)和活力回收率的影響Fig.5 Effect of pH on purification fold and activity recovery of LOXs

2.6 掃描電鏡

分別用水提取法和TPP法獲得的LOXs酶蛋白的SEM圖像如圖6所示。由圖6可知,2種方法得到的脂氧酶形貌完全不同。LOXs酶蛋白在粗提物中的微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為聚集在一起的絮狀沉淀。TPP法制備的LOXs酶可能是由于(NH4)2SO4和叔丁醇的共同作用,受各種力的影響,形成較為明顯的光滑片狀結(jié)構(gòu),呈結(jié)晶狀沉淀。

a.粗提的脂氧酶；b.三相純化的脂氧酶圖6 粗提法和三相法所得脂氧酶的SEM圖Fig.6 SEM images of the interfacial precipitate and crude LOXs

2.7 SDS-PAGE分析

分別對(duì)粗提和TPP純化的LOXs酶進(jìn)行SDS-PAGE分析,以估計(jì)該酶的分子質(zhì)量,檢查其分離純度,結(jié)果如圖7所示。值得注意的是,TPP法得到的LOXs純度有較大提高。泳道2的酶帶較少,比泳道1清晰很多,表明LOXs酶得到了部分純化,分子質(zhì)量約為97 kDa,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)[7-8]。

1-粗提酶；2-三相純化的脂氧酶；3-商品脂氧酶；4-標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖7 脂氧酶的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE analysis of recovered and purified LOXs from soy flours

3 結(jié)論

在pH 8和25 ℃條件下,采用60%(NH4)2SO4飽和度、粗酶液與叔丁醇比例為1∶2.5的TPP體系從大豆粉中提取LOXs,活性回收率為78.2%,純化倍數(shù)為8.2倍,首次證明了TPP用于脫脂大豆粉部分純化LOXs的可行性。這種TPP技術(shù)在降低操作成本、簡(jiǎn)化操作步驟等方面對(duì)獲得LOXs蛋白有一定的幫助。