發酵乳中內源性苯甲酸產生的影響因素

王偉佳,劉愛國*,廖振宇,劉立增,孫麗婷,楊紅,劉蕊,劉長旭,李雨軒

1(天津商業大學 生物技術與食品科學學院,天津市食品生物技術重點實驗室,天津,300134)2(譜尼測試科技(天津)有限公司,天津,300392)

苯甲酸(benzoic acid)又叫安息香酸,常常在食品中作為防腐劑使用[1]。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[2]中規定了其在各類食品中允許使用的限量要求,如在食品中超范圍或超限量使用會對人體肝臟產生危害,甚至致癌。但在日常檢驗過程中發現，部分食品中天然存在苯甲酸,因此,內源性的苯甲酸為食品的日常監管檢驗產生一定的困擾。孫屏等[3]研究發現，新疆紅棗中天然苯甲酸平均值為84 mg/kg；張青云等[4]報道了蜂蜜中含有不超過15 mg/kg的苯甲酸；SIEBER等[5]的研究發酵乳的苯甲酸含量能達到50 mg/kg。一般來說,內源性苯甲酸產生有以下3種途徑[6-8]:馬尿酸水解、苯丙氨酸代謝、苯甲醛氧化。國家標準中規定發酵乳中不允許使用苯甲酸[2],但在實際檢測中,由于原料乳在乳酸菌的作用下,馬尿酸脫甘氨酸產生苯甲酸[9],因而發酵乳中經常被檢出苯甲酸天然殘留。隨著消費者越來越關心飲食安全,為降低發酵乳中內源性苯甲酸的含量,保障百姓尤其兒童身體健康[10],本論文通過研究不同濃度的全脂乳粉、發酵溫度、時間、pH、乳酸菌種類對發酵乳中苯甲酸產生的影響,初步探究發酵乳中苯甲酸產生的規律,為乳品質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

全脂乳粉,新西蘭恒天然集團；白砂糖,廣西上上糖業有限公司；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌,普爾斯(天津)國際貿易有限公司；發酵乳,超市。

馬尿酸標準品、苯甲酸標準品,中國計量科學研究院；甲醇(色譜純),美國Hipure Chem 公司；乙酸鋅(分析純),天津市福晨化學試劑廠；亞鐵氰化鉀(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、硫酸(優級純)、冰乙酸(分析純),天津市風船化學試劑科技有限公司；乳酸(分析純),北京純奇商貿有限責任公司；碳酸氫鈉(分析純),天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.1.2 儀器設備

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀、CNW C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),日本Shimadzu公司；WTL-4K離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；KQ-800DE超聲儀,昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵乳的制備

水預熱(50 ℃)→復原乳[10%全脂乳粉，6%白砂糖，均為質量分數(下同)]→殺菌(85 ℃,20 min)→冷卻降溫(40 ℃)→接入發酵劑(0.04%嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌混合發酵劑)→攪拌(10 min)→ 保溫發酵(42 ℃,5 h)→冷藏保存(4 ℃)[11]

1.2.2 樣品前處理

稱取 20 g 樣品(精確至 0.01 g)于100 mL 容量瓶中,加入 25 mL 0.1 mol/L NaOH溶液,混合后置于超聲波水浴或 70 ℃水浴中處理15 min。冷卻后,用 0.5 mol/L H2SO4溶液調pH到8,分別加入 2 mL 92 g/L亞鐵氰化鉀溶液和183 g/L 乙酸鋅溶液。劇烈振搖,靜置 15 min,混合后冷卻到室溫,甲醇定容,靜置 15 min,4 000 r/min 離心,上清液經 0.22 μm 濾膜過濾。收集濾液,用于高效液相色譜儀測定樣品中馬尿酸和苯甲酸含量[12]。

1.2.3 全脂乳粉添加量的確定

分別以6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉添加量進行發酵乳制作。

1.2.4 發酵初始酸度確定

按照1.2.1小節的方法進行發酵乳制備,在發酵前分別用乳酸調節復原乳pH至3、4、5和6,用碳酸氫鈉溶液調節pH至7,然后進行發酵。

1.2.5 發酵溫度確定

按照1.2.1小節的方法制備發酵乳,分別控制發酵溫度為25、35、42、45和50 ℃。

1.2.6 發酵時間控制

按照1.2.1小節制備發酵乳,每隔1 h進行發酵乳的采集,直至發酵6 h。

1.2.7 乳酸菌種類控制

按照1.2.1小節制備發酵乳,改變發酵劑類型,分別以嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌作為發酵劑進行發酵。

1.2.8 色譜條件

高效液相色譜柱溫箱柱溫為40 ℃,進樣量10 μL,以0.4%乙酸和甲醇為流動相,流速1 μL/mL,進行等度洗脫,檢測波長為240 nm。

1.2.9 數據分析

全部數據用SPSS 23.0分析,采用Origin 9.5 以及Office 2019繪制圖表。

2 結果與討論

2.1 苯甲酸與馬尿酸HPLC方法驗證

2.1.1 線性范圍、線性方程以及檢出限

配制質量濃度為0、0.1、0.5、1、5、10、20 μg/mL的馬尿酸和苯甲酸標準溶液,上機檢測,10 μg/mL標準溶液譜圖如圖1所示。結果表明,在0～20 μg/mL質量濃度范圍內有著比較好的線性關系,馬尿酸和苯甲酸的相關系數分別為0.999 8和0.999 7,線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限[13](3 S/N)、定量限[13](10 S/N)如表1所示。發酵乳樣品色譜圖見圖2。由實驗結果可知該方法對馬尿酸和苯甲酸有著較高的分離度,且靈敏度好。

表1 馬尿酸與苯甲酸檢測的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit for hippuric acid and benzoic acid

圖1 不同濃度馬尿酸、苯甲酸標準品液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of different concentrations of hippuric acid and benzoic acid standards

圖2 發酵乳樣品液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of fermented milk sample

2.1.2 回收率和精密度

取發酵乳樣品,分別對其做1、5和10 μg/mL的加標回收實驗(表2),樣品按照1.2.2和1.2.3小節的方法進行處理。馬尿酸和苯甲酸的回收率分別為97.46%、98.67%。

表2 發酵乳樣品馬尿酸與苯甲酸的回收率Table 2 Recovery of hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

選取一個發酵乳樣品,進行7次平行實驗,測定相應的峰面積(表3)。結果表明,馬尿酸與苯甲酸的RSD分別為0.405%和1.298%,均小于15%,該方法有較好的重復性和準確性[14]。

表3 發酵乳樣品馬尿酸與苯甲酸的精密度測定Table 3 Repeatability analysis of hippuric acid and benzoic acid in yogurt

2.2 發酵乳中苯甲酸產生的影響因素

2.2.1 全脂乳粉含量的影響

分別添加6%、8%、10%、12%、14%的全脂乳粉,0.02%嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌混合發酵劑,發酵溫度40 ℃,發酵6 h制備發酵乳。測定發酵完成的樣品中馬尿酸和苯甲酸含量,結果如圖3所示。

圖3 不同全脂乳粉濃度發酵乳中馬尿酸和苯甲酸含量Fig.3 Contents of hippuric acid and benzoic acid in fermented milk with different whole milk powder concentration

隨著乳粉含量的增加,發酵乳中馬尿酸的含量也相應提高。全脂乳粉在6%～14%的范圍內,發酵前發酵乳中馬尿酸含量為23.732～55.667 μg/mL,發酵后馬尿酸含量明顯降低,其范圍在20.402～35.997 μg/mL;苯甲酸在全脂乳粉含量為14%的發酵乳中含量最高,為(12.078±0.135)μg/mL。結果表明發酵乳中苯甲酸的含量與原料乳中馬尿酸水平呈正相關。

2.2.2 發酵初始酸度的影響

發酵乳發酵前加入乳酸調節pH(3～7),觀察初始pH對發酵乳中苯甲酸產生的影響。發酵條件與1.2.1小節一致,實驗結果如圖4所示。在發酵過程中,當初始pH<6時,隨著pH值的升高,苯甲酸的含量逐漸遞增,同時,馬尿酸的含量逐步降低。當pH值>6時,發酵乳中苯甲酸含量呈下降趨勢。乳酸菌最適生長pH為5.5～6.5[15-17],當初始pH<4時,樣品中馬尿酸轉化成苯甲酸的能力較弱,苯甲酸含量較低。

圖4 不同pH對發酵乳中馬尿酸和苯甲酸的影響Fig.4 Effects of different pH on hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

2.2.3 發酵溫度的影響

觀察在25、35、40、45、50 ℃下發酵乳中馬尿酸和苯甲酸的變化規律。40 ℃下,苯甲酸含量達到最高值,為(10.448±0.576)μg/mL。高于40 ℃時,苯甲酸含量隨著發酵溫度的升高,呈下降趨勢(圖5)。

圖5 發酵溫度對發酵乳中馬尿酸和苯甲酸的影響Fig.5 Effects of temperature on hippuric acid and benzoic acid in fermented milk

文獻表明苯甲酸產生的最佳溫度分別為40 ℃以及38.12 ℃[18-19],與本實驗結果較為一致。當發酵溫度為40 ℃時,乳酸菌處于最佳的代謝溫度,代謝強度也達到較高的水平,從而促進了馬尿酸的水解,產生更多的苯甲酸。

2.2.4 發酵時間的影響

在發酵過程中,每隔1 h取1次樣品,進行發酵乳中馬尿酸和苯甲酸檢測,觀察在發酵過程中馬尿酸和苯甲酸的轉化規律。隨著發酵時間的延長,苯甲酸含量呈現上升趨勢,馬尿酸含量與之相反,且在2～4 h內苯甲酸含量增加較快(圖6),之后趨于平緩。SIGITA等[20]報道乳酸菌處于生長對數期時,馬尿酸轉化苯甲酸的速度較快。

圖6 發酵過程中苯馬尿酸和苯甲酸的變化Fig.6 Changes of benzoic acid and benzoic acid during fermentation

2.2.5 乳酸菌種類的影響

以不同的乳酸菌作為發酵劑制備發酵乳,比較不同菌種之間產生苯甲酸的差異。在選取的5種發酵劑中雙歧桿菌產生的苯甲酸含量最低(0.238 μg/mL),以鼠李糖乳桿菌作為發酵劑的樣品中苯甲酸含量最高(10.355 μg/mL)。作為發酵乳中常用的保加利亞乳桿菌,也產生較高濃度的苯甲酸(圖7)。

圖7 發酵乳中不同發酵劑對苯甲酸含量的影響Fig.7 Effects of different starter on benzoic acid content in fermented milk

在YU等[19]的研究中,當發酵24 h時,鼠李糖乳桿菌發酵的發酵乳苯甲酸含量為13.89 μg/mL,由雙歧桿菌產生的苯甲酸為1.43 μg/mL。實驗結果表明,發酵乳中苯甲酸的產生受到發酵劑類型的影響。

2.3 市售發酵乳中苯甲酸含量的檢測

從超市購買12個不同品牌的發酵乳,分析不同發酵乳中苯甲酸之間的含量差異,結果見表4所示。所有樣品中均有苯甲酸的檢出,含量范圍為0.73～7.373 μg/mL,平均值為2.692 μg/mL,與譚連英等[21]報道的保質期內發酵乳的苯甲酸含量接近。市售酸奶中不同品牌間苯甲酸存在差異(P<0.05),分析其原因:一是不同品牌的發酵乳配料及含量存在差異,尤其是原料乳方面；二是不同廠家使用的發酵劑的類型不一,不同乳酸菌之間產苯甲酸能力不同；三是不同發酵乳之間的發酵時間存在差異。

表4 不同市售發酵乳中馬尿酸和苯甲酸含量差異Table 4 Difference of hippuric and benzoic acid contents in various market fermented milk

3 結論

通過研究不同含量的全脂乳粉、發酵溫度、發酵時間、pH、乳酸菌種類5個因素，了解發酵乳中苯甲酸產生的影響因素。結果表明,所有發酵乳中均有苯甲酸的檢出,以上5個因素對發酵乳中苯甲酸產生均有一定的影響。在不同含量的全脂乳粉中,發酵乳中苯甲酸的含量與原料乳中馬尿酸水平呈正相關；在發酵過程中,當初始pH<6時,隨著pH值的升高,苯甲酸的產生逐漸遞增；在發酵溫度40 ℃下,產生苯甲酸的含量達到最高值；乳酸菌處于生長對數期時,馬尿酸轉化苯甲酸的速度較快；在選取的5種不同發酵劑中,雙歧桿菌產生的苯甲酸含量最低。本研究為發酵乳中苯甲酸的監管檢驗提供了科學參考。