干腌牛肉加工過程中蛋白質變化對品質的影響

伏慧慧,馬雪蓮,普莉雯,王念念,袁湖川,黃桂芳,王慶玲

(石河子大學 食品學院,新疆 石河子,832000)

新疆高海拔的優良天然牧場,賦予畜產品肉質細嫩、適口性好、綠色無污染的特性。此外,牛肉具有高蛋白、低脂、低膽固醇、富含維生素及礦物質等營養特性。依托新疆優質牛肉資源,借鑒傳統發酵肉制品加工技術制得的干腌牛肉肉質鮮美、風味獨特且貯藏性好。然而,目前干腌牛肉的加工過分依賴自然環境,產品品質不穩定且風味差異大,安全性得不到保障。

干腌肉制品加工過程中的品質變化涉及肌肉組織中多種物質的氧化、合成、降解、相互作用等,具有復雜的合成-代謝網絡和調控-互作網絡。蛋白質作為原料肉的主要化學成分,在干腌肉制品加工中通過水解、氧化、產物互作等多種途徑影響發酵和成熟過程中產品的風味、色澤和質構。腌臘肉制品加工過程中因蛋白質水解、氧化及其結構的改變,產生多種有助于品質形成的低分子質量風味前體物質[1-2]。肌漿蛋白和肌原纖維蛋白通過內源酶的水解作用產生的肽、氨基酸等化合物參與產品滋味、風味的形成過程[3-4]。劉肖等[5]研究發現蛋白質降解生成的肽及游離氨基酸對酸肉產品滋味及風味的形成有一定促進作用。馬艷梅[6]證實了蛋白質變化對羊肉火腿感官和風味品質的影響作用。

目前,新疆牛肉資源豐富,然而干腌牛肉加工過程中蛋白質變化對品質影響研究鮮有報道。鑒于此,本實驗以不同加工階段的干腌牛肉為研究對象,借助色度、質構評價產品品質,并對加工過程中游離氨基酸、蛋白質氧化指標、降解程度及結構變化進行研究,以期明確蛋白質變化對干腌牛肉品質的影響,為干腌牛肉產品進一步品質研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛后腿,石河子市農貿市場；2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)、過硫酸銨、考馬斯亮藍 R-250、鹽酸胍、甘氨酸、尿素等,分析純,麥克林試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Multifuge X1R 高速冷凍離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Neofuge-15R酶標儀,美國伯爵儀器有限公司；YS3060色差儀,深圳三恩時科技有限公司；TA.XTplus質構儀,英國Stable Micro Systems公司；S3500激光粒度儀,美國麥克儀器公司；Bruker Senterra 拉曼光譜儀,德國布魯克公司；Mini-protein Ⅲ凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

工藝流程：新鮮牛肉→修整→腌制→風干→發酵→成熟→成品

工藝條件：鮮牛肉于4 ℃下預冷放置48 h,修整定型后,按原料質量的6.5%食鹽量揉搓并于8 ℃、65%條件下腌制30 d；腿肉清洗后于10 ℃、相對濕度 60%風干30 d；20 ℃、相對濕度70%發酵30 d后調整溫度至25 ℃、相對濕度75%,繼續發酵30 d,最后于28 ℃、相對濕度70%成熟30 d即得成品。

分別于原料期(0 d)、腌制期(30 d)、風干期(60 d)、發酵中期(90 d)、發酵后期(120 d)、成熟期(150 d)6個階段進行樣品采集,-20 ℃冷藏備用。

1.3.2 色度的測定

在室溫條件下選擇各時期的牛肉切片,使用色差儀進行色度測定,測量之前進行系統校正。測定樣品的亮度(L*)、紅度(a*)、黃度(b*)。每個時期的樣品均進行3次測定。飽和度(c)、彩度(h)、總色差(ΔE)計算如下：

(1)

c=(a*×2*+b×2)×0.5

(2)

(3)

1.3.3 質構的測定

將各時期牛肉樣品切成小塊(3 cm×3 cm×2 cm),使用質構儀測定。測定參數為：探頭類型為P/50,使用2個35壓縮的連續循環,循環間隔為5 s,測前速度為3 mm/s、測試速度為1 mm/s、測后速度為2 mm/s,觸發力為10 g。

1.3.4 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取

參考冉麗丹等[7]的方法提取干腌牛肉中蛋白質。剔除肉樣表面肉眼可見脂肪并破碎。稱取5.00 g樣品于離心管中,加入10 mL磷酸鹽緩沖液(A液,pH 6.5)勻漿混勻,于4 ℃、5 000 r/min離心15 min后,過濾收集上清液,此步驟重復2次,上清液即為肌漿蛋白溶液(SP)。向上述所得沉淀中加入10 mL磷酸鹽緩沖液(B液,pH 6.5),勻漿混勻于4 ℃、5 000 r/min離心15 min后,過濾收集上清液,此步驟重復2次,上清液即為肌原纖維蛋白溶液(MP),雙縮脲法測定蛋白濃度。

1.3.5 羰基含量的測定

將肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液稀釋至1 mg/mL 與DNPH溶液反應并于370 nm處測定吸光值,采用摩爾消光系數22 000 L/(mol·cm)計算羰基含量[9]。

1.3.6 總巰基含量的測定

將質量濃度為1 mg/mL肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液與5,5′-二硝基(2-硝基苯甲酸)反應并于412 nm處測定吸光值,采用摩爾消光系數為13 600 L/(mol·cm)計算總巰基含量[9]。

1.3.7 SDS-PAGE

參照鄧小蓉等[10]的方法：選用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳,各時期的上樣量為5 μL,電泳初始電壓為75 V,當樣品進入分離膠后上調電壓至120 V。電泳結束后,將膠片剝出,考馬斯亮藍R-250染色30 min,再用脫色液進行3次脫色,直至膠片透明,根據標準蛋白Marker的相對遷移率獲得蛋白質分子質量。

1.3.8 拉曼光譜的測定

將各加工時期的蛋白溶液進行真空冷凍干燥后,通過拉曼顯微系統進行數據采集,分辨率為5～9 cm-1,激發波長為785 nm,激光功率為100 mW,每個樣品掃描3次,記錄100～3 000 cm-1頻率范圍內的拉曼信號光譜[11],并進行數據分析。

1.3.9 粒徑的測定

將肌漿蛋白和肌原纖維蛋白溶液超聲30 min,使用激光散射器測定蛋白質的粒徑。以去離子水作為分散劑,顆粒折射率1.414,顆粒吸收率為0.001,每個樣品重復測定3次,記錄數據并進行分析[12]。

1.3.10 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定參照GB 5009.124—2016的方法：準確稱取各時期肉樣50 mg于水解管,加入10 mL 6 mol/L HCl溶液及苯酚3滴。放入冷凍劑冷凍5 min,于110 ℃水解24 h。準確吸取1.0 mL水解濾液于50 ℃減壓干燥,殘留物溶解于1 mL蒸餾水,蒸干后加入1 mL檸檬酸鈉緩沖溶液溶解,過0.22 μm微孔濾膜,衍生化后測定各時期氨基酸含量。分析條件：分離柱柱溫55 ℃；反應柱柱溫135 ℃；流速0.4 mL/min；波長570 nm (除Pro)和440 nm (Pro)。

1.4 數據統計與分析

實驗中每個指標重復測定3次,其值用MEAN±SD表示。SPSS Statistics 25.0統計軟件進行數據ANOVA分析,Origin 2018軟件用于圖表繪制,相關性熱圖及主成分分析圖使用R 3.6.1軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 干腌牛肉加工過程中色度的變化

色澤影響消費者對肉制品喜好程度,是判定肉制品新鮮度的重要指標。干腌牛肉加工過程中的色澤變化如表1所示,表征產品色度的各指標整體呈現顯著下降趨勢(P<0.05)。L*的持續下降可能與脂肪氧化的加劇、食鹽的滲透、水分含量的降低有關[13]。a*從原料期到發酵中期不斷降低,從發酵后期開始逐漸回升,這可能是在有氧環境中肌紅蛋白被氧化成高鐵肌紅蛋白導致牛肉紅度下降,而酸性環境中產生的NO與肌紅蛋白螯合生成亞硝基肌紅蛋白導致紅度逐漸回升[14]。b*呈現波動變化,這可能與水分的減少、氯化物的作用、脂肪的氧化以及細胞膜的破壞導致鐵離子的釋放等有關[15]。本研究中干腌牛肉色度變化規律與ROBERTO等[16]對豬肉火腿色度變化的研究結果相同。飽和度、彩度變化與紅度和黃度變化趨勢相似,總色差隨著加工時間的延長而降低,在發酵中期之前下降最顯著,可能與干腌牛肉在加工過程中脂肪和蛋白質氧化降解有關。

表1 不同加工時期干腌牛肉色度的變化Table 1 Changes of color in dry-cured beef during different processing periods

2.2 干腌牛肉加工過程中質構的變化

質構與原料肉加工過程中的組織結構和狀態變化密切相關,實驗結果表明,干腌牛肉各加工時期的質構變化顯著(P<0.05),除彈性、黏聚性外,其他指標均表現出顯著增加的趨勢(表2)。硬度與蛋白質結構的變化密切相關,蛋白質分子的伸展及聚集導致其結構改變,從而在一定程度上影響產品質地[15,17]。干腌牛肉硬度、咀嚼性、膠著性的增加可能與水分含量的降低、食鹽和發酵作用共同導致的蛋白變性以及氯化物含量升高有關。加工過程中干腌牛肉的彈性先降后升以及回彈性增加可能是肌纖維被食鹽破壞及蛋白質凝膠形成的作用結果。肌肉在酶和微生物代謝的共同作用導致黏聚性、黏性的變化[18]。干腌牛肉的咀嚼性與硬度、黏聚性和彈性有關,黏聚性越高,咀嚼時越細膩[19]。經發酵成熟后的牛肉肉質緊實,咀嚼性和口感有所改善,進而提升了干腌牛肉的食用品質。

表2 不同加工時期干腌牛肉質構的變化Table 2 Changes of texture of dry-cured beef during different processing periods

2.3 干腌牛肉加工過程中蛋白質氧化規律

圖1 干腌牛肉加工過程中羰基和巰基含量的變化Fig.1 Changes of carbonyl and sulfhydryl content of dry-cured beef during the processing

由圖1得知,干腌牛肉加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的巰基含量顯著下降(P<0.05),成熟期的含量相對原料期分別下降了40.70%、49.27%。巰基含量的降低可能是由于氧化破壞蛋白質空間結構,使巰基轉化為分子之間、分子內二硫鍵或氧化成次磺酸,亞磺酸和磺酸[9]；也可能是隨著加工溫、濕度的升高,氧化促進蛋白質表面聚集,從而使能檢測到的巰基含量降低。肉品加工中蛋白質表面的半胱氨酸中的游離硫醇基被氧化成二硫鍵,使蛋白質與水分結合的能力減弱,導致了持水能力的降低,對產品品質產生間接影響。崔文斌等[22]發現牦牛肉肌原纖維蛋白的巰基含量同樣呈現顯著下降趨勢。

2.4 SDS-PAGE分析

由圖2-a可知,干腌牛肉加工過程中肌漿蛋白發生一定程度的降解。肌漿蛋白主要由肌酸激酶(100 kDa)、磷酸化酶(90 kDa)、磷酸果糖激酶(82.4 kDa)、磷酸葡糖異構酶(60 kDa)、肌酸激酶(30～40 kDa)以及磷酸三糖異構酶(28 kDa)等組成。35 kDa蛋白片段從腌制期開始顏色加深,之后新增1條蛋白片段,30 kDa以下及70、140 kDa從腌制期開始有新的蛋白片段出現,這可能是蛋白質變性或小分子蛋白重新聚合成大分子蛋白質所導致的。40、55、90 kDa蛋白條帶在整個加工過程中都存在;60、70 kDa蛋白條帶在腌制期隨著加工顏色逐漸加深至成熟期變淺;31 kDa條帶在原料期顏色深,之后變淺消失。說明加工過程中食鹽滲透及生化反應使肌漿蛋白發生顯著降解形成牛肉的滋味和風味前體物質[23]。

由圖2-b可知,肌原纖維蛋白主要有副肌球蛋白(100 kDa)、α-肌動蛋白(94 kDa)、原肌球蛋白(80 kDa)、肌鈣蛋白(75 kDa)、肌動蛋白(43 kDa)、肌球蛋白輕鏈(20 kDa)等組成。隨著加工的進行,蛋白片段發生了不同的變化,40 kDa左右可能是輔肌動蛋白,從原料期蛋白條帶顏色深且寬隨著加工逐漸變淺,43、60 kDa蛋白條帶在整個加工過程中存在,這與SUN等[24]研究廣式香腸在加工過程中蛋白質的變化有相似的結果。70 kDa從加工至風干期的蛋白條帶顏色淺,之后顏色加深;80 kDa從發酵中期出現新的蛋白片段;130、135 kDa蛋白條帶在原料期和腌制期顏色較深,之后顏色變淺,甚至有的條帶完全消失;30 kDa以蛋白下條帶加工過程中有的變淺,同時也有新的蛋白條帶出現。說明蛋白質降解成小分子片段,使原有的蛋白質結構發生變化,進而間接影響干腌牛肉的組織結構。

M-標準蛋白;1-原料期;2-腌制期;3-風干期;4-發酵中期;5-發酵后期;6-成熟期a-肌漿蛋白;b-肌原纖維蛋白圖2 干腌牛肉加工過程中蛋白質 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE ofproteins during the processing of dry-cured beef

2.5 干腌牛肉加工過程中蛋白粒徑的分析

粒徑可反映蛋白質顆粒大小及蛋白質分子間的聚集情況。干腌牛肉加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白粒徑的變化如圖3所示,蛋白質整體朝著大粒徑方向聚集。與原料期相比,成熟期的干腌牛肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在加工過程中粒徑有所增加,說明干腌牛肉蛋白質變性導致蛋白質聚集體形成。然而,整個加工過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白粒徑呈現波動增加狀態,此結果表明干腌牛肉加工中不僅出現蛋白質變性聚集,與之相伴的可能還有蛋白質降解、蛋白聚集體的逐漸形成及蛋白聚集體的解離現象[24],該實驗結果與ZHOU等[25]報道的蛋白質修飾和水分分布對金華火腿粒徑影響的結果相似。此外,粒徑的增加可能與蛋白質氧化有關,蛋白質氧化有助于二硫鍵的形成及蛋白質的聚集,導致蛋白質結構變化,促進加工中干腌牛肉品質形成。

a-肌漿蛋白;b-肌原纖維蛋白圖3 干腌牛肉加工過程中蛋白質粒度變化Fig.3 Changes of particle size of protein during the processing of dry-cured beef

2.6 干腌牛肉加工過程中蛋白拉曼光譜分析

干腌牛肉加工過程中蛋白質二級結構堆積條形圖變化如圖4所示,肌漿蛋白二級結構改變對α-螺旋(30.13%)和β-折疊(28.3%)含量的影響較大,即α-螺旋含量增加,β-折疊含量先降低后升高,β-轉角含量下降,而無規卷曲含量呈波動變化。這可能與加工過程中食鹽的滲透或成熟使蛋白質發生變性或聚集有關。肌原纖維蛋白二級結構發生顯著變化,在原料期β-折疊(23.55%)、β-轉角(21.66%)影響最大,其次是α-螺旋(20.34%),而無規卷曲的含量最低(17.26%)。經發酵成熟后,α-螺旋含量和β-折疊含量呈現波動變化,而β-轉角和無規卷曲含量呈無規則變化。其原因可能是α-螺旋解旋生成了β-折疊或無規卷曲,β-轉角和β-折疊相互轉化。蛋白質構象直接決定了蛋白質二級結構之間的變化與轉換,通過影響風味吸附特性,間接影響產品感官品質[26]。

1-原料期;2-腌制期;3-風干期;4-發酵后期;5-;6-成熟期圖4 干腌牛肉加工過程中蛋白質二級結構變化Fig.4 Changes of protein secondary structure during the processing of dry-cured beef

2.7 干腌牛肉加工過程中游離氨基酸的變化

游離氨基酸主要由蛋白質和多肽水解形成,是揮發性芳香化合物的來源,對改善制品的特征風味具有重要作用[27]。干腌牛肉加工過程中游離氨基酸的變化如表3所示,游離氨基酸總量增長顯著(P<0.05),成品中游離氨基酸總量約為原料的2倍,說明蛋白質降解貫穿于干腌牛肉的整個加工過程,對產品滋味和風味的形成具有重要貢獻作用。必需氨基酸與非必需氨基酸的比例為25∶39,必需氨基酸與總氨基酸的比例為25∶64,非必需氨基酸與總氨基酸的比例為25∶41。成熟期結束時以Glu、Asp、Leu、Ala、Lys含量較多,這些氨基酸在物質呈味方面起著關鍵性的作用[28],Glu、Asp呈鮮味,Ala、Lys具有一定的甜味,而Leu呈苦味。大部分游離氨基酸的含量隨著加工進程都有不同程度增加,這與ZHANG等[29]報道的氧化作用下豬肉游離氨基酸變化趨勢一致。檢測出的游離氨基酸中Ser、Tyr、Leu的含量隨著加工時間延長呈上升趨勢,而Ala、Phe、Lys、His、Met等呈現波動變化。各游離氨基酸的相互作用有助于形成產品特有的滋味,有研究表明,Val、Leu、Ile、Phe和Met在香腸中相互作用可顯著加強滋味強度[30]。同時,Val、Ile、Leu、Met、Cys通過Strecker降解生成2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、含硫化合物、吡嗪[31],這些物質有助于產品特征性風味的形成。Glu、Thr、Met、Ala、His、Val等氨基酸通過α-酮酸代謝生成醛,進而促進相應的羧酸和醇的形成,對干腌牛肉的整體香氣和滋味產生重要影響[32]。

表3 不同加工時期干腌牛肉中游離氨基酸含量變化 單位：mg/(100 g)

2.8 干腌牛肉加工中品質形成與蛋白質降解的相關性關系

圖5-a為干腌牛肉加工過程中色度、質構與蛋白質變化的主成分分析圖,由第1主成分66.5%和第2主成分15.4%解釋了總變異81.9%,表明PC1、PC2提取了干腌牛肉加工中蛋白質降解變化與品質的主要特征。由圖5-a可知,硬度、咀嚼性、黏聚性、黏性、巰基、羰基主要位于PC1上,而肌漿蛋白β-折疊,肌原纖維蛋白β-轉角、β-折疊、α-螺旋主要在PC2上。干腌牛肉加工過程中品質貢獻率最大的是成熟期的硬度、咀嚼性、肌漿蛋白羰基和腌制期的肌漿蛋白β-轉角,而發酵中期的黏聚性、肌漿蛋白無規卷曲貢獻率次之。此外,6個聚類分布在不同的區域表明色澤、質構及蛋白質降解變化在干腌牛肉加工的不同時期具有顯著差異性。

a-主成分分析;b-相關性分析圖5 干腌牛肉加工中品質與蛋白質降解指標主成分分析和相關性分析Fig.5 Principal component analysis and correlation analysis of quality and protein degradation indexes during the processing of dry-cured beef

干腌牛肉加工過程中色度、質構與蛋白質氧化指標、結構變化間相關性關系如圖5-b所示,干腌牛肉加工中的品質形成過程與蛋白質變化具有顯著相關性。產品色度與黏性、巰基含量、SP β-轉角呈極顯著正相關(P<0.01),而與硬度、咀嚼性、黏聚性、膠著性、回彈性、羰基含量、MP α-螺旋呈極顯著負相關(P<0.01),表明加工過程中蛋白質氧化改變了蛋白質結構,使產品的光散射作用以及肌紅蛋白存在狀態改變,色澤發生變化,進而影響干腌牛肉的感官品質。硬度與咀嚼性、膠著性、回彈性、羰基含量、SP α-螺旋呈極顯著正相關(P<0.01),與色度、黏性、巰基含量、SP β-轉角呈極顯著負相關(P<0.01),咀嚼性的相關性變化與硬度相似,說明在加工過程中蛋白質降解使干腌牛肉的質構發生了復雜的變化,使肌肉的咀嚼性和口感有所提升,進而影響產品的食用品質。因此,干腌牛肉品質與蛋白質氧化及結構變化密切相關。

3 結論

本研究證實了干腌牛肉加工過程中品質變化及蛋白質氧化、變性和聚集現象。與原料期相比,干腌牛肉加工過程中蛋白質氧化持續加深,由變性聚集導致的蛋白質顆粒朝大粒徑方向遷移,蛋白質二級結構向無序轉變,肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在加工過程中均發生顯著降解；品質分析表明干腌牛肉硬度、咀嚼性、回復性升高增加了產品質構品質,游離氨基酸持續增加促進產品風味和滋味的形成。相關性分析說明加工中蛋白質持續氧化顯著影響產品色澤的形成過程,蛋白質降解使干腌牛肉的質構發生了復雜的變化,使肌肉的咀嚼性和口感有所提升,進而提升產品的食用品質。綜上,蛋白質變化對干腌牛肉品質具有密切相關性,對干腌牛肉質構、滋味、風味及色澤均產生積極促進作用。本研究為深入探討干腌牛肉加工過程中的品質變化機理提供理論基礎,為實現干腌牛肉工業化進程提供助力。