大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的理化指標及抗氧化活性分析

曹聯飛,何程豪,孫玉敬*

1(浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所,浙江 杭州,310021)2(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310014)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物混合后,經充分釀造而成的天然甜物質[1]。蜂蜜成分復雜,營養豐富,具有多種生物學活性,是一種傳統的功能性食品[2]。根據蜜蜂采集的植物種類數量,蜂蜜可分為單花蜜和百花蜜,進一步按照采集的具體植物,單花蜜又可分為油菜蜜、洋槐蜜、棗花蜜、枇杷蜜等數十種；此外也可根據生產蜂蜜的蜜蜂種類來劃分,由西方蜜蜂(Apismellifera)生產的蜂蜜俗稱為意蜂蜜或洋蜂蜜,由東方蜜蜂(Apiscerana)生產的蜂蜜俗稱為中蜂蜜或土蜂蜜[3]。

除市場上常見的洋蜂蜜和近些年發展迅速的土蜂蜜外,我國自然分布的蜜蜂屬(Apisgenus)其他蜂種如大蜜蜂、黑大蜜蜂、小蜜蜂、黑小蜜蜂,以及無刺蜂屬(Trigonagenus)的蜜蜂也可以生產蜂蜜。但是由于這些蜜蜂種類處于野生狀態,蜂蜜產量稀少,季節性也很強,市場上未大量流通。大蜜蜂(Apisdorsata)別名排蜂、馬長蜂,主要分布于我國云南、廣西、海南及周邊的南亞和東南亞熱帶地區,主要在樹上筑巢；黑大蜜蜂(Apislaboriosa)別名巖蜂、喜馬拉雅排蜂、雪山蜜蜂,主要分布于我國的云南西北部、西藏及相鄰的尼泊爾、不丹、緬甸等喜馬拉雅山脈高海拔地區,主要在懸崖上筑巢[4]。大蜜蜂和黑大蜜蜂的個體較大,采集能力強,蜂巢也較大,因此在采蜜季節單群貯蜜量很大,且常常多個蜂群聚集分布。近年來,隨著人們對野生蜂蜜和高端蜂蜜的追捧,大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜價格不斷攀升,采蜜季節尋蜂取蜜的當地人也越來越多,逐漸形成了一定的市場規模。然而目前關于我國大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的相關研究還很少。

國內外關于蜂蜜理化指標和抗氧化物質測定以及抗氧化性活性評價的研究較多[5]。著名的新西蘭麥卡盧蜂蜜中含有多種多酚類物質,具有較強的抗氧化能力[6]。曹煒等[7]測定了10種蜂蜜的總酚酸含量和抗氧化活性,發現蕎麥蜜的總酚酸含量較高,蜂蜜中總酚酸的含量與其抗氧化活性成正相關。郭夏麗等[8]對洋槐蜜等7種不同蜜源蜂蜜的總酚、總黃酮含量及抗氧化能力進行研究,發現蜂蜜顏色越深,總酚與總黃酮含量越高,其抗氧化能力越強。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的相關研究主要集中在國外。研究發現,尼泊爾大蜜蜂蜂蜜[9]和巴基斯坦大蜜蜂蜂蜜[10]的理化指標符合國際標準,泰國大蜜蜂蜂蜜[11]可能含有一種可以抑制某些細菌生長的抗菌肽。對馬來西亞不同蜂種采集的不同單花蜜的理化指標和抗氧化活性比較分析發現,大蜜蜂蜂蜜具有最強的抗氧化活性[12]。本研究以我國主要分布區的大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜為研究對象,參照相關標準測定基本理化指標,測定蜂蜜中的抗氧化物質(總黃酮、總酚)及抗氧化能力(DPPH自由基清除能力、還原能力),同時與國內外相關研究對比分析,以期為我國主要野生蜂蜜的品質評價提供基礎數據,同時有助于規范相關蜂蜜產業的發展。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

大蜜蜂蜂蜜樣品采自我國大蜜蜂主要分布區的云南、廣西和海南,其中4個云南樣品采自云南西雙版納,5個廣西樣品采自廣西崇左,5個海南樣品采自海南五指山。黑大蜜蜂蜂蜜樣品采自我國黑大蜜蜂主要分布區的云南和西藏,其中5個云南樣品采自云南文山,4個西藏樣品采自西藏日喀則。每個蜂蜜樣品來自一個蜂群,采集后低溫運輸至實驗室,-20 ℃保存備用。另外采集1個西方蜜蜂洋槐蜜和1個東方蜜蜂枇杷蜜做抗氧化對比分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 理化指標的測定

參照《中華人民共和國供銷合作行業標準-蜂蜜》(GH/T 18796—2012)[3]進行測定。水分測定參照《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準-進出口蜂蜜檢驗規程》(SN/T 0852—2012),果糖、葡萄糖、蔗糖含量測定參照《食品安全國家標準 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》(GB 5009.8—2016),羥甲基糠醛測定參照《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定方法 液相色譜-紫外檢測法》(GB/T 18932.18—2003),淀粉酶值測定參照《蜂蜜中淀粉酶值的測定方法-分光光度法》(GB/T 18932.16—2003)。每個地區的蜂蜜樣品以及不同蜂種的蜂蜜樣品計算平均數和標準差。

1.2.2 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu 法[13],具體方法參考郭夏麗等[8]。吸取1 mL稀釋后的蜂蜜水溶液(200 mg/mL),加入1 mL的Folin-Ciocalteu試劑,混勻,然后加入5 mL 1 mol/mL的Na2CO3溶液,用蒸餾水定容至10 mL,混合均勻,室溫避光條件下放置1 h,于760 nm波長下測定其吸光值,平行測定3次。配制不同濃度的沒食子酸溶液,采用相同方法繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中的總酚含量,以沒食子酸的相對量表示(mg GAE/100 g honey)。

1.2.3 總黃酮含量的測定

蜂蜜中總黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法[14-15]。稱取20 g蜂蜜,加入丙酮15 mL,超聲萃取20 min后,回旋振蕩5 min,重復提取3次,合并所得上清液,利用旋轉蒸發儀45 ℃減壓濃縮至干,用甲醇溶解定容至10 mL。取5 mL溶液,加入6 mL水,1 mL 25 g/L的NaNO2,搖勻靜置6 min。加入1 mL 50 g/L的Al(NO2)3,搖勻靜置6 min。加入10 mL 22 g/L的NaOH,加水稀釋搖勻,靜置15 min,于510 nm波長下測定其吸光值,平行測定3次。配制不同濃度的蘆丁溶液,采用相同方法繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品中的總黃酮含量,以蘆丁的相對量表示(mg RE/100 g honey)。

1.2.4 DPPH自由基清除實驗

DPPH自由基清除實驗參考王海敏等[16]?，F配0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液,分別加入0.004、0.008、0.012、0.016、0.02、0.024 g/mL的蜂蜜水溶液,混合均勻,室溫避光靜置反應30 min,于517 nm 波長處測定吸光度。測定空白對照的吸光度值。計算每個樣品對DPPH自由基的清除率。再計算出IC50值。

1.2.5 還原能力的測定

參考曹煒等[17]的方法。在試管中分別加入不同質量濃度的蜂蜜樣品(0.075、0.1、0.125、0.15 g/mL),磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH 6.6)和1 g/L的鐵氰化鉀溶液,混合均勻,置于50 ℃水浴中反應20 min,然后加入10 g/L的三氯乙酸溶液,搖勻。在700 nm波長處測定吸光度。吸光度增加表明還原力增強。

2 結果與分析

2.1 理化指標測定結果

各個地區大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜樣品的主要理化指標見表1。

水分含量高低是決定蜂蜜成熟程度的主要指標。大蜜蜂蜂蜜樣品的水分含量平均值為(21.25±0.87)%。黑大蜜蜂蜂蜜樣品的水分含量平均值為(21.52±1.07)%。各個地區大蜜蜂蜂蜜和黑大蜜蜂蜂蜜樣品的水分含量平均值在20%～24%，在23個蜂蜜樣品中,僅1個大蜜蜂蜂蜜樣品的水分含量低于20%。因此,大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜樣品的水分含量均達到行業標準二級蜂蜜要求。已有研究表明,尼泊爾大蜜蜂蜂蜜的水分含量平均在23%左右[9],印度大蜜蜂蜂蜜的水分含量接近24%[18],巴基斯坦大蜜蜂蜂蜜的水分含量平均在22%左右[10],泰國大蜜蜂蜂蜜的水分含量接近23%[19],馬來西亞[12]和泰國[19]的大蜜蜂蜂蜜的水分含量均高于西方蜜蜂蜂蜜和東方蜜蜂蜂蜜。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜水分含量較高,可能與分布地區和筑巢習性有關。大蜜蜂主要分布在熱帶雨林地區,濕度和溫度較高,黑大蜜蜂產蜜季節的降水量也很高,因此蜜蜂蒸發花蜜中的水分相對困難。大蜜蜂屬于露天營巢,水分容易進入,而西方蜜蜂和東方蜜蜂通常在洞穴筑巢。

表1 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜理化指標Table 1 Physicochemical indexes of Apis dorsata honey and Apis laboriosa honey

我國蜂蜜行業標準和蜂蜜食品安全國家標準(GB 14963—2011)[1]均規定果糖和葡萄糖的總含量≥60%。結果顯示,各個地區大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜樣品,果糖平均含量在35%左右,葡萄糖含量在30%左右,二者總含量在65%左右,符合標準要求。所有23個樣品中,除1個大蜜蜂和1個黑大蜜蜂蜂蜜樣品,其他樣品的葡萄糖和果糖總含量均>60%。我國蜂蜜行業標準和蜂蜜國家標準均規定蔗糖含量≤5%,測定結果顯示各個地區大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜樣品,除1個大蜜蜂蜂蜜樣品,其他樣品均符合標準,其中20個蜂蜜樣品的蔗糖含量<2%。尼泊爾大蜜蜂蜂蜜的果糖含量在40%左右,葡萄糖在20%左右,蔗糖在20%左右[9]。馬來西亞大蜜蜂蜂蜜的總還原糖含量接近62%,蔗糖含量為1.66%[12]。蜂蜜的糖類指標與植物來源相關[20],不同國家和地區蜜源植物的不同,使花蜜中的糖含量存在差異,從而會造成蜂蜜的糖含量及組成存在差異。尼泊爾大蜜蜂蜂蜜的蔗糖含量過高可能與附近甘蔗種植有關[9]。

蜂蜜中的羥甲基糠醛(hydroxymethylfurfural,HMF)含量主要反映了蜂蜜的新鮮度。新鮮蜂蜜中一般不含HMF,如果長期加熱或貯藏,蜂蜜中的氨基化合物與葡萄糖發生Maillard反應或者蜂蜜中的還原糖發生脫水反應生成HMF[21]。測定結果顯示所有樣品的HMF質量分數在1 mg/kg左右,遠優于蜂蜜行業標準(≤40 mg/kg)。已有研究顯示,尼泊爾大蜜蜂蜂蜜的HMF在30.36～56.10 mg/kg[9],馬來西亞大蜜蜂蜂蜜約為60 mg/kg[12],巴基斯坦大蜜蜂蜂蜜在30.44～89.93 mg/kg[10]。熱帶地區由于氣溫較高,HMF含量也通常較高[12]。本研究中所有樣品的HMF含量較低,可能與本研究的樣品貯存有關。為了測定抗氧化活性等其他指標,本研究的樣品采集后即低溫運輸至實驗室-20 ℃保存。目前我國大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜產量很低,價格很高,大多都是在采蜜季節通過直銷的方式售賣,運輸時間較短,所以HMF含量應該也較低。

蜂蜜中的淀粉酶值含量高低可作為判斷成熟蜜與非成熟蜜、原蜜與加熱蜜、新蜜與陳蜜的依據。未經充分釀造的蜂蜜,淀粉酶含量低,經高溫加熱處理或貯藏過久的蜂蜜,其淀粉酶會受到破壞[21]。我國蜂蜜行業標準規定,淀粉酶值≥4 [mL/(g·h)]。測定結果顯示大蜜蜂蜂蜜樣品中,8個樣品的淀粉酶值<4,其余6個樣品的淀粉酶值在4～7；黑大蜜蜂蜂蜜樣品中,3個樣品的淀粉酶值<4,其余6個樣品的淀粉酶值在4～12。部分蜂蜜樣品的淀粉酶值未達到標準要求,可能與蜂蜜的成熟度有關。目前大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的人工取蜜方式粗放,無法保證蜂蜜的成熟度,因此淀粉酶值可能差異較大。

2.2 總酚和總黃酮測定結果

所有大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜樣品的總酚和總黃酮含量測定結果見表2。

蜂蜜樣品之間總酚含量差異較大。云南大蜜蜂蜂蜜在49.97～144.32 mg GAE/100 g honey,平均值為(100.52±39.57)；海南大蜜蜂蜂蜜在31.63～58.27 mg GAE/100 g honey,平均值為(41.94±12.17)；廣西大蜜蜂蜂蜜在47.74～113.31 mg GAE/100 g honey,平均值為(82.96±23.64)；云南黑大蜜蜂蜂蜜在35.20～87.17 mg GAE/100 g honey,平均值為(49.60±21.56)；西藏黑大蜜蜂蜂蜜在73.77～117.66 mg GAE/100 g honey,平均值為(88.23±20.00)。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的總酚含量要明顯高于中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜。總體上,云南大蜜蜂蜂蜜總酚含量最高,其次是西藏黑大蜜蜂蜂蜜和廣西大蜜蜂蜂蜜,最后是云南黑大蜜蜂蜂蜜和海南大蜜蜂蜂蜜。在相同測定方法下,馬來西亞大蜜蜂蜂蜜的總酚含量約為35 mg/100 g[12],低于本研究中的大部分蜂蜜樣品,與海南大蜜蜂蜂蜜樣品總酚含量比較接近。與相同測定方法的國內已有研究比較,本研究中的中蜂蜜和西蜂蜜的總酚含量接近我國神農架林區的中蜂蜜(20.69～31.71 mg/100 g)[22],大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜大部分樣品的總酚質量分數高于迪慶中蜂百花蜜(56.4～72.1 mg/100 g)[23],也高于我國常見的荊條蜜(30.32 mg/100 g)[24]和椴樹蜜(12.23～35.06 mg/100 g)[25]。

表2 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的總酚和總黃酮含量Table 2 Contents of total phenols and flavonoids of A.dorsata honey and A.laboriosa honey

總黃酮含量在不同蜂蜜樣品之間差異也較大。云南大蜜蜂蜂蜜在0.67～1.39 mg RE/100 g honey,平均值為(0.97±0.35)；海南大蜜蜂蜂蜜在0.42～3.23 mg RE /100 g honey,平均值為(1.47±1.06)；廣西大蜜蜂蜂蜜在0.38～4.36 mg RE/100 g honey,平均值為(1.40±1.67)；云南黑大蜜蜂蜂蜜在0.64～1.57 mg RE /100 g honey,平均值為(0.93±0.38)；西藏黑大蜜蜂蜂蜜在1.11～1.98 mg RE /100 g honey,平均值為(1.55±0.43)?？傮w上,西藏黑大蜜蜂蜂蜜總黃酮含量最高,其次是海南大蜜蜂蜂蜜、廣西大蜜蜂蜂蜜,然后是西蜂洋槐蜜、云南大蜜蜂蜂蜜和云南黑大蜜蜂蜂蜜,最后是中蜂枇杷蜜。相同測定方法的國內已有研究顯示,苕子蜜的總黃酮含量在0.842～2.295 mg/100 g[16],新疆黑蜂、中華蜜蜂、喀爾巴阡蜂所產的百花蜜總黃酮含量分別約為1.3、0.5、0.6 mg/100 g[26]。大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜樣品的總黃酮含量與這些研究結果相當。

不同地區的大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的總酚含量和總黃酮含量差異較大,可能與不同地區的蜜源植物種類差異有關,與已有研究一致[12]。

2.3 抗氧化能力測定結果

DPPH自由基清除能力測定得到的IC50值如圖1所示,不同蜂蜜樣品之間差異較大。IC50值越小,說明蜂蜜對自由基的清除能力越強。西藏黑大蜜蜂蜂蜜的IC50較小,平均為(13.66±3.22)mg/mL,顯示出較強的抗氧化能力。大部分廣西大蜜蜂蜂蜜的IC50也較小,抗氧化能力較強。云南的黑大蜜蜂蜂蜜的IC50普遍較大,平均為(152.96±60.15)mg/mL,抗氧化能力較弱。

圖1 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜清除DPPH自由基的IC50Fig.1 IC50 of A.dorsata honey and A.laboriosa honey against DPPH free radicals注:樣品編碼對應表2

中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜的IC50分別為(128.48±13.33)和(245.65±24.17)mg/mL,抗氧化能力也較弱。

還原能力測定結果如圖2所示,不同蜂蜜樣品也顯示出不同的還原能力。總體來看,還原能力測定結果與DPPH自由基清除能力測定結果一致,DPPH自由基清除能力較強的西藏黑大蜜蜂蜂蜜和廣西大蜜蜂蜂蜜還原能力也較強；DPPH自由基清除能力較弱的中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜的還原能力也較弱。

圖2 大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的還原能力Fig.2 Reducing power of A.dorsata honey and A.laboriosa honey

綜合分析蜂蜜樣品中總酚和總黃酮含量與抗氧化能力,西藏黑大蜜蜂蜂蜜總黃酮含量最高,總酚含量也較高,抗氧化能力最強；廣西大蜜蜂蜂蜜的總酚和總黃酮含量較高,抗氧化能力也較強；中蜂枇杷蜜和西蜂洋槐蜜的總酚含量較低,抗氧化能力較弱?？寡趸芰εc總酚和總黃酮的含量有一定的相關性,與已有研究結果一致[7,16,22]。

3 結論

本研究測定我國主要分布區的大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的理化指標、抗氧化物質(總黃酮、總酚)及抗氧化能力(DPPH清除能力、還原能力)。各樣品水分含量達到蜂蜜行業標準二級蜂蜜要求,果糖和葡萄糖總含量、蔗糖含量基本都達到蜂蜜行業標準和蜂蜜國家標準要求,羥甲基糠醛含量很低,部分蜂蜜樣品的淀粉酶值未達到行業標準要求。蜂蜜樣品間總酚、總黃酮含量差異較大,抗氧化能力差異也較大,可能與不同地區的蜜源植物種類差異有關。我國大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的總酚含量高于馬來西亞大蜜蜂蜂蜜,也高于我國常見的一些中蜂蜜和西蜂蜜,值得深入研究開發。未來需要對不同地區大蜜蜂和黑大蜜蜂蜂蜜的植物來源進行分析,同時開展安全性指標檢測。