L-異亮氨酸及其衍生物代謝工程研究進展

蘆楠,李宇虹,陳寧,張成林

(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

L-異亮氨酸(L-isoleucine)又稱“異白氨酸”,因具有分支的甲基基團,故與L-纈氨酸和L-亮氨酸通稱為“分支鏈氨基酸”[1]。L-異亮氨酸屬于高附加值氨基酸,具有修復肌肉的功能,常被制成氨基酸輸液或口服液,用于治療肝硬化、肥胖癥、昏迷等病癥[2-4]。近年來,L-異亮氨酸作為抗血糖藥物4-羥基異亮氨酸的合成前體受到廣泛關注[5-6]。L-異亮氨酸的生產方法主要包括化學合成法、毛發提取法和發酵法[7-9],目前發酵法是其工業化生產的主要方法,生產菌株通常為谷氨酸棒桿菌,大腸桿菌亦有研究報道[10]。本文從L-異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝調控機制、L-異亮氨酸及其衍生物的代謝工程改造策略進展進行了綜述,旨在為其代謝工程研究提供參考。

1 L-異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝調控機制

1.1 L-異亮氨酸的生物合成途徑

由于L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸等氨基酸均來源于L-天冬氨酸,故合稱為天冬氨酸族氨基酸[2]。L-異亮氨酸的生物合成途徑涵蓋了中心代謝和分支代謝途徑：葡萄糖進入細胞后經糖酵解途徑(Embden-Meyerhof-Parnas pathway,EMP)和磷酸戊糖途徑(hexose monophophate pathway,HMP)生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸,在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或(和)丙酮酸羧化酶的作用下發生羧化反應,生成草酰乙酸；后者在轉氨酶的作用下生成L-天冬氨酸；L-天冬氨酸經10步催化反應生成L-異亮氨酸,其中涉及5個限速酶(天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸脫氫酶和乙酰羥基酸合成酶)；合成的L-異亮氨酸經運輸載體輸出至胞外,具體合成和運輸途徑如圖1所示。由圖1可知,合成1 molL-異亮氨酸的需要1 molL-天冬氨酸、1 moL丙酮酸、2 mol 腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)和4 mol 還原力還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)。

1.2 L-異亮氨酸代謝調控

盡管谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的L-異亮氨酸合成途徑相同,但其相關酶及其編碼基因具有多樣性(表1)。如前所述,草酰乙酸是合成L-異亮氨酸的前體物質,但谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的草酰乙酸來源有所差異：大腸桿菌中草酰乙酸主要來源于三羧酸循環及乙醛酸循環,但亦可通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的回補反應獲得；而在谷氨酸棒桿菌中草酰乙酸主要通過丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的回補反應獲得,其中丙酮酸羧化酶為主要羧化酶[11]。值得注意的是,丙酮酸羧化酶以生物素為輔酶。因此,在L-異亮氨酸發酵過程中常需要添加玉米漿、酵母粉等富含生物素的有機氮源以保證丙酮酸羧化酶的高效催化活性,同時降低L-丙氨酸、乳酸等以丙酮酸為前體的副產物[12]。

圖1 L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調控機制Fig.1 Biosynthesis pathway and metabolic regulation metabolism of L-isoleucine注：Glucose,葡萄糖；Glucose-6-P,葡萄糖-6-磷酸；PEP,磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr,丙酮酸；OAA,草酰乙酸；Asp,天冬氨酸；Asp-P,天冬氨酸磷酸；ASA,天冬氨酸-β-半醛；Hom,高絲氨酸；Hom-P,高絲氨酸磷酸；Thr,蘇氨酸；α-KB,α-酮基丁酸；AHB,α-乙酰基-α-羥基丁酸；DMV,α-β-二羥基-β-甲基戊酸；KMV,α-酮基-β-甲基戊酸；AL,α-乙酰乳酸；DIV,α-β-二羥基異戊酸；KIV,α-酮基異戊酸；Ile,異亮氨酸；Val,纈氨酸；Leu,亮氨酸；Lys,賴氨酸；Met,甲硫氨酸；PHBV,3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯；ppc,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因；pyc,丙酮酸羧化酶編碼基因；lysC,天冬氨酸激酶編碼基因；asd,天冬氨酸半醛脫氫酶編碼基因；hom,高絲氨酸脫氫酶編碼基因；thrB,高絲氨酸激酶編碼基因；thrC,蘇氨酸合成酶編碼基因；ilvA,蘇氨酸脫氫酶編碼基因；ilvBN,乙酰羥基酸合成酶編碼基因；ilvC,二羥酸還原異構酶編碼基因；ilvD,二羥酸脫水酶編碼基因；ilvE,支鏈氨基酸轉氨酶編碼基因；leuA,α-異丙基蘋果酸合成酶編碼基因；leuB,β-異丙基蘋果酸脫氫酶編碼基因；leuCD；α-異丙基蘋果酸異構酶編碼基因；ATP,腺嘌呤核苷三磷酸；ADP,腺嘌呤核苷二磷酸；NADPH,還原型輔酶Ⅱ；NADP+,煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸；propionyl-coA,丙酰輔酶A；phaABC,PHBV合成途徑中的基因簇(下同)

表1 大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中L-異亮氨酸分支合成途徑相關酶Table 1 Enzymes involved in L-isoleucine biosynthesis in Escherichia coli and Corynebacterium glutamate

除L-異亮氨酸外,L-天冬氨酸還可用于合成L-賴氨酸等多種氨基酸,這些氨基酸無疑與L-異亮氨酸的合成競爭代謝流。天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)是L-異亮氨酸分支合成途徑中的第一個關鍵酶酶,該酶催化的反應需要ATP。在大腸桿菌中,存在該酶的3種同工酶,分別為AK I、AK II和AK III(分別由thrA、metL和lysC基因編碼)；其中AK I和AK II為雙功能酶,同時具有天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶活性,且AK I起主要作用。此外,在大腸桿菌中thrA與高絲氨酸激酶編碼基因thrB及蘇氨酸合成酶編碼基因thrC共同組成thrABC操縱子,該操縱子上游含有弱化子編碼基因thrL。當環境中或胞內L-蘇氨酸或(和)L-異亮氨酸的濃度過高時,ThrL對thrABC操縱子有弱化作用[13]。AK I和AK III受到L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協同反饋抑制,而AK II受L-甲硫氨酸的反饋阻遏[10]。然而,在谷氨酸棒桿菌中,僅含有1個天冬氨酸激酶(由lysC基因編碼),該酶受到L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制[9]。

高絲氨酸脫氫酶是L-異亮氨酸分支合成途徑第2個關鍵酶,該酶需要還原力NADPH。大腸桿菌中含有由thrA和metL編碼的高絲氨酸脫氫酶。而在谷氨酸棒桿菌中,僅含1個高絲氨酸脫氫酶編碼基因hom,與高絲氨酸激酶編碼基因thrB構成hom-thrB基因簇。該基因簇受到L-蘇氨酸的反饋抑制作用和L-甲硫氨酸的反饋阻遏[14]。有報道稱,thrB(A20G)可解除L-蘇氨酸反饋抑制作用[15]。

蘇氨酸脫氫酶和乙酰羥基酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-異亮氨酸合成途徑中最關鍵的2個酶。其中蘇氨酸脫氫酶催化L-蘇氨酸合成α-酮基丁酸,往往受到L-異亮氨酸的反饋抑制[16]。大腸桿菌含有ilvA、tdcB編碼的2個同工酶,而谷氨酸棒桿菌中僅含1個有由ilvA編碼的蘇氨酸脫氫酶。

由圖1所示,L-異亮氨酸和L-纈氨酸合成均需AHAS、二羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉氨酶。AHAS受L-異亮氨酸的反饋抑制作用。在大腸桿菌內共含有AHAS的3個同工酶(AHAS I、AHAS II和AHAS III,分別由ilvBN,ilvGM和ilvIH所編碼)。其中AHAS I對丙酮酸的特異性較α-酮基丁酸強,因此更有利于L-纈氨酸和L-亮氨酸的合成。而編碼AHAS II的ilvGM基因存在移碼突變,故該酶不表達。AHAS III對α-酮基丁酸的特異性高于丙酮酸,故研究者認為該酶更有利于L-異亮氨酸的合成[10]。

而在谷氨酸棒桿菌中僅含有1種ilvBN編碼的乙酰羥酸合酶[4],ilvBN與二羥酸還原異構酶編碼基因ilvC組成ilvBNC操縱子。α-酮基丁酸對該操縱子有誘導作用,故當α-酮基丁酸積累時ilvBNC操縱子啟動轉錄[17]。此外,ilvBNC操縱子上游還含有弱化子,該弱化子能夠感受L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸濃度,當其積累時,弱化子對ilvBNC操縱子的轉錄起到弱化作用[18],其弱化調控機制如圖2所示。

圖2 谷氨酸棒桿菌ilvBNC基因的表達調控機制Fig.2 Regulation mechanism for ilvBNC expression in C.glutamicum

在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中僅含1種ilvC編碼的二羥酸還原異構酶,該酶需要還原力NADPH。此外,在大腸桿菌中二羥酸脫水酶編碼基因ilvD和支鏈氨基酸轉氨酶編碼基因ilvE以及ilvGM和ilvA組成操縱子ilvGMEDA；而在谷氨酸棒桿菌中ilvD和ilvE獨立存在。

L-異亮氨酸的攝入和輸出均需要運輸載體。在大腸桿菌中,其輸出載體為ygaZH編碼的YgaZH,其攝入載體分別為livJ和brnQ編碼的LivJ和BrnQ[2]。而谷氨酸棒狀桿菌中L-異亮氨酸的攝入和輸出載體分別為brnQ和brnFE編碼的BrnQ和BrnFE。除L-異亮氨酸外,BrnFE還可識別并輸出L-纈氨酸和L-亮氨酸[19]。brnFE的轉錄受亮氨酸應答調控蛋白(leucine responsive regulatory protein,Lrp)和上述3種氨基酸的調控,當其中1種氨基酸積累時,該氨基酸可介導Lrp激活brnFE的轉錄。

2 L-異亮氨酸合成途徑的代謝工程改造

依據L-異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝調控機制,其代謝工程改造策略主要包括：(1) 解除代謝物對關鍵酶的反饋作用；(2) 切斷或弱化支路代謝途徑；(3) 修飾轉運系統；(4) 增強輔助因子的供應(表2)。

2.1 解除代謝物對關鍵酶的反饋作用

天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸脫氫酶及乙酰羥基酸合成酶是L-異亮氨酸合成途徑的關鍵酶,受相應代謝物的反饋抑制或(和)反饋阻遏。故欲過量積累L-異亮氨酸,首先應解除代謝物對關鍵酶的反饋作用,以疏通其合成代謝流。

表2 L-異亮氨酸代謝途徑改造策略匯總Table 2 Summary of L-isoleucine metabolic pathway modification strategies

天冬氨酸激酶受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制,1 mmolL-蘇氨酸可抑制酶活力41%、1 mmolL-賴氨酸可抑制酶活力45%,當二者同時存在時可抑制酶活力82%[9]。lysC突變體(lysCA279T)可解除該反饋抑制作用,過表達突變體可使L-蘇氨酸的產量增加80%[9]。此外,亦有文獻報道通過減弱L-賴氨酸的積累部分解除其對天冬氨酸激酶的反饋抑制作用[20]。高絲氨酸脫氫酶受L-蘇氨酸反饋抑制,目前已報道多個解除該反饋抑制作用的高絲氨酸脫氫酶突變體。如homG378S和homG378E均可不同程度地解除反饋抑制作用,過表達homG378S和homG378E使L-蘇氨酸產量由0.09 g/L和0 g/L分別提高至3.62 g/L和4.6 g/L[9,20]。WANG等[21]利用L-異亮氨酸生產菌C.glutamicumYILW 過表達來源于大腸桿菌解除反饋抑制作用的thrABC操縱子后,L-異亮氨酸產量達到13.8 g/L,提高5.3%。GUILLOUET等[22]通過過表達解除反饋抑制的高絲氨酸激酶和蘇氨酸脫氫酶使得L-異亮氨酸產量達到2.2 g/L,提高5倍。

蘇氨酸脫氫酶受L-異亮氨酸的反饋抑制,目前已報道的多個突變體ilvAV140M、ilvAF383A、ilvAV140M/F383A均可不同程度地解除其反饋抑制,過表達這些突變體可使L-異亮氨酸產量(0.55、0.63和0.73 g/L)分別提高17%、34%、55.3%[16]。過表達ilvAV323A突變體使L-異亮氨酸提高到1.18 g/L[20]。此外,異源表達蘇氨酸脫氫酶也可解除L-異亮氨酸的反饋抑制作用。GUILLOUET等[23]在谷氨酸棒桿菌中過表達來源于大腸桿菌tdcB基因,當反應體系中L-異亮氨酸濃度達到26.2 g/L時仍保留60%的初始酶活,L-異亮氨酸產量達到2.5 g/L,較出發菌株提高50倍。

乙酰羥基酸合成酶受L-異亮氨酸反饋抑制作用,已發現的突變體ilvBNI47Y和ilvBNP176S/D426E/L575 W均可不同程度地解除其反饋抑制作用。過表達ilvBNI47Y和ilvBNP176S/D426E/L575 W可使L-異亮氨酸產量分別達到22.7和4.17 g/L,提高10%和67.5%[24-25]。

2.2 切斷或弱化支路代謝途徑

天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑中,代謝流在經天冬氨酸-β-半醛和L-高絲氨酸后分別流向L-賴氨酸和L-甲硫氨酸等分支途徑。切斷或弱化L-賴氨酸和L-甲硫氨酸等分支途徑,可有效提高L-異亮氨酸產量和轉化率并降低副產物的積累。敲除L-丙氨酸合成基因alaT可降低L-丙氨酸的積累并促使丙酮酸流向草酰乙酸。WANG等[21]敲除該基因使得L-異亮氨酸產量達到15.4 g/L,提高17.6%,L-丙氨酸濃度有所降低[24]。ZHANG等[24]敲除該基因L-異亮氨酸產量達到18.8 g/L,提高1.6%。DONG等[26]敲除二氫二醇脫氫酶編碼基因ddh后使得L-賴氨酸積累量降低30%,L-異亮氨酸產量達3.81 g/L,提高8%。

2.3 修飾轉運系統

當胞內L-異亮氨酸積累達到一定濃度后,由輸出載體運輸至胞外。L-異亮氨酸合成的最后一步轉氨反應為可逆反應,因此將積累的L-異亮氨酸及時輸出可促進該轉氨反應,并可解除其對關鍵酶的反饋抑制作用[27]。此外,攝入載體BrnQ可將胞外的L-異亮氨酸運輸至胞內,不利于其高效積累[19]。

YIN等[28]通過在谷氨酸棒桿菌中過表達轉錄調控因子Lrp和輸出載體BrnFE編碼基因使得L-異亮氨酸產量達到26.9 g/L,增加63%。XIE等[29]過表達brnFE使得L-異亮氨酸產量達到25.9 g/L,提高24.9%,在此基礎上敲除攝入載體編碼基因brnQ使得L-異亮氨酸產量達到29.0 g/L,提高28%。然而,ZHANG等[24]敲除brnQ基因后L-異亮氨酸產量達到20 g/L,提高6%。PARK等[10]在大腸桿菌內中過表達輸出載體編碼基因ygaZH,使得L-異亮氨酸產量達到1.11 g/L,較出發菌株(0.322 g/L)提高2.45倍。

另外,研究表明核糖體延伸因子(由fusA編碼)和循環因子(由frr編碼)可促進轉運蛋白合成。單獨過表達或共表達這2種因子后,L-異亮氨酸產量分別達到10.4(過表達fusA)、10.1(過表達frr)和10.9 g/L(過表達fusA-frr),較出發菌株提高了40.5%、36.4%、47.2%[30]。

2.4 增強輔助因子的供應

合成1 molL-異亮氨酸需要4 mol NADPH,該途徑中hom、asd、ilvC和ilvE等基因編碼的酶均需要NADPH作為輔酶。增加NADPH的供應常用策略是增強NADPH相關合成酶的表達水平,如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(由zwf編碼)和NAD激酶(由ppnk編碼)等。SHI等[31]分別單獨過表達及共表達zwf和ppnk,發現均能提高胞內NADPH的濃度和L-異亮氨酸產量,而二者共表達效果最佳,使得L-異亮氨酸產量達到4.10 g/L,提高85.9%。ZHANG等[24]通過過表達ppnk使得L-異亮氨酸產量達到21.6 g/L,提高4.9%。MA等[32]通過過表達HMP途徑關鍵酶編碼基因gnd、pgl和fbp增強該途徑代謝流以增加NADPH的供應,經發酵L-異亮氨酸產量達到28.97 g/L,提高24.9%。

3 L-異亮氨酸衍生物的生物合成

常見L-異亮氨酸衍生物包括4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)和3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate,PHBV),目前均已實現其生物合成。

3.1 4-HIL的生物合成

4-HIL具有葡萄糖濃度依賴的促進胰島素分泌的活性,對I型和II型糖尿病動物均具有治療效果[33]。此外,4-HIL還具有增強肌細胞對血糖吸收、促進脂肪代謝、降血脂以及保護肝功能等作用[34]。4-HIL生物合成是以L-異亮氨酸、α-酮戊二酸和O2為底物,由異亮氨酸羥化酶(isoleucine dioxygenase,IDO,由ido基因編碼)催化生成[35]。KIVERO等[36]將ido轉化至大腸桿菌并在發酵過程中添加L-異亮氨酸,實現前體物添加法合成4-HIL,優化條件下產量為163.0 mmol/L。SHI等[37-38]利用谷氨酸棒桿菌過表達ido,在優化條件下經144 h發酵,最高產量達到95.7 mmol/L。ZHANG等[39]在L-異亮氨酸生產株C.glutamicumYI內構建4-HIL合成途徑,通過增強羧化途徑和三羧酸循環代謝流,并弱化乙醛酸循環以及丙酮酸和谷氨酸合成代謝流,顯著提高了4-HIL的產量。同時,采用基于L-異亮氨酸濃度的α-酮戊二酸脫氫酶活性動態調控策略調節三羧酸循環代謝流量,實現了α-酮戊二酸和L-異亮氨酸代謝的動態平衡以及4-HIL的高效合成。經64 h發酵后4-HIL產量、單位菌體產量、轉化率及發酵強度分別達到34.21 g/L、1.87 g/g DCW、15%和0.53 g/(L·h)。

3.2 PHBV的生物合成

PHBV由3-羥基戊酸輔酶A和3-羥基丁酸輔酶A縮合而成,具有短時間內可降解性,被公認為“綠色塑料”。其中3-羥基戊酸輔酶A前體物丙酰輔酶A主要來源于L-異亮氨酸合成前體α-酮基丁酸[40]。MA等[41]通過在L-異亮氨酸生產菌C.glutamicumWM001中表達關鍵酶編碼基因phaA、phaB和phaC構建了PHBV合成途徑。獲得的重組菌株WM001/pDXW-8-phaCAB實現L-異亮氨酸和PHBV聯產,產量分別為15和29.8 g/L。

4 展望

L-異亮氨酸作為8種必需氨基酸之一,在醫藥、化妝品、食品等領域應用廣泛,其衍生物種類和應用也在不斷拓展。盡管L-異亮氨酸已實現大規模生產,但與L-色氨酸等必需氨基酸相比成本較高,限制了其在飼料等領域的應用。究其原因主要是菌種產量和轉化率低、發酵周期長、菌株遺傳穩定性差、發酵過程控制精細程度不高等問題。針對上述問題,今后的工作應聚焦于以下方面：(1) 采用適應性進化或常壓室溫等離子體誘變結合高通量篩選等技術,選育穩定性和環境耐受性強等性狀優良的底盤細胞；(2) 基于多組學手段分析L-異亮氨酸代謝流量,根據系統生物學及合成生物學理論和技術,篩選解除反饋抑制且活性無損失或低損失的關鍵酶突變體,挖掘和運用底物或(中間)產物偶聯的基因回路動態調節關鍵節點,實現高效產酸和生長的平衡；(3) 基于代謝流定量分析,結合生產菌株代謝特性,進一步挖掘影響L-異亮氨酸合成的限制因子,優化L-異亮氨酸發酵條件和過程控制,同時深入了解L-異亮氨酸發酵參數和生理狀態的聯系,實現發酵過程的智能控制,提高發酵的穩定性。