干細胞治療終末期肝病的臨床研究進展

余瀅瀅，王福生，施 明

1 干細胞治療肝病概述

近年來，關于干細胞尤其是成體干細胞，在治療肝臟疾病的基礎研究和臨床研究方面都取得了重要進展，為進一步推進臨床應用奠定了基礎。目前研究較多且相對成熟的是間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）。MSCs存在于多種組織及器官，例如臍帶組織、臍帶血、胎盤、外周血、脂肪組織、骨髓等，其中骨髓中含量最為豐富。MSCs由于其多能性和多向性等特征，可以作為種子細胞應用于修復或替代受損及病變的多種組織器官，從而為目前一些無法有效治愈的重大疾病提供嶄新的治療手段，對再生醫學產生重要的影響。此外，MSCs也可以釋放各種生長因子和細胞因子，參與調節炎癥和免疫反應，這使其免疫調節功能越來越受到關注。因此，MSCs已成為治療炎癥性或自身免疫性疾病的重要細胞來源。除了MSCs以外，應用經粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF）動員或未經動員的骨髓CD34+干細胞也是治療肝病常用的干細胞種類。

2 干細胞治療肝病的證據和機制

1999年Petersen等[1]在鼠肝內發現由骨髓干細胞（bone marrow stem cells,BMSCs）或骨髓造血干細胞轉化形成的肝卵圓細胞甚至成熟的肝細胞和膽管細胞，首次描述了干細胞在一定條件下可以轉化為肝細胞這一現象。Theise等[2]在異性間骨髓移植或肝移植的受體中也發現了來源于供體的肝細胞和膽管細胞。Alison等[3]在開展的一項臨床試驗中發現移植了男性骨髓細胞的女性患者肝臟內同樣出現了Y染色體陽性的肝細胞。Korbling等[4]通過肝臟組織標本活檢在移植了男性外周血干細胞的女性患者肝臟內也發現了來自男性供體的XY染色體陽性的肝細胞。上述研究結果都證明骨髓和外周血干細胞在人體內可以分化為肝細胞，但在當時這些干細胞的起源及其產生肝細胞方式都尚未知曉。而之后的動物實驗也表明骨髓細胞或骨髓來源的MSCs（bone marrow derived MSCs,BM-MSCs）對急性肝損傷的動物肝臟有保護作用，能提高動物的生存率[5]。于是人們逐漸認識到，基于干細胞的多向分化和多能性，干細胞在肝病治療方面存在巨大潛力，并逐步開展了大量的小規模臨床研究。

以往認為，干細胞治療是通過提供大量肝細胞樣細胞替代受損的肝細胞功能來改善肝功能和恢復肝臟正常結構。但隨著對干細胞治療肝病機制的進一步了解，目前認為干細胞通過旁分泌機制改變組織微環境比向肝細胞樣細胞的轉分化更重要[6]。例如，MSCs可以通過旁分泌功能發揮局部效應，為肝臟提供營養和有利于增生修復的環境，促進受損肝臟增生及肝臟血管再生，抑制免疫細胞增殖及向肝臟遷移，調節肝臟及全身免疫炎癥反應，從而減輕肝臟的損傷[7]。MSCs可以通過分泌IL-10、轉化生長因子β（transforming growth factor β,TGF-β）、前列腺素 E2 等誘導調節性T細胞（regulatory T cell,Treg）的產生，抑制過度的炎癥反應，減輕肝臟炎癥，改善肝臟微環境，抑制肝細胞凋亡，促進肝細胞再生；通過分泌IL-10和TNF-α抑制肝星狀細胞的活性，或通過Fas/FasL途徑促進星狀細胞的凋亡，從而抑制肝纖維化的形成[8-9]。例如有臨床研究表明，應用自體BM-MSCs治療HBV相關終末期肝病，患者肝功能明顯改善的同時，外周血中Treg、Th17細胞以及細胞因子TGF-β、IL-17、TNF-α、IL-6水平發生明顯改變，這一結果提示了MSCs具有調節免疫改善肝臟炎癥環境的能力[10]。此外，MSCs也可以通過釋放促細胞增生因子和基質金屬蛋白酶-9刺激內源性肝細胞再生[11-12]。而來源于MSCs分泌的外泌體內含有豐富的蛋白質和miRNA，可以通過抑制肝細胞上皮-間充質轉化和膠原生成來改善肝纖維化，也可以通過抑制肝星狀細胞內的某些特定的信號通路（如抑制Smo的表達來抑制Hh信號的激活）來抑制細胞的增殖和激活，從而減輕肝纖維化的形成[13]。MSCs還可以提高肝組織血紅素加氧酶-1（heme oxygenase,HO-1）的表達，通過HO-1的抗炎、抗凋亡作用，改善肝臟炎癥環境，減少肝細胞凋亡，促進肝功能的恢復[14]。

3 干細胞治療肝病的臨床研究

目前，開展干細胞治療肝病臨床研究常用的干細胞為MSCs，以及經G-CSF骨髓動員后獲取的干細胞。MSCs主要為自體或異體BM-MSCs，以及臍帶來源的MSCs（umbilical cord-derived MSCs,UC-MSCs）。Mohamadnejad等[15]最早報道了關于MSCs治療病毒性肝炎導致的終末期肝病的臨床研究（見表1）。在該臨床試驗中慢性HBV感染相關的失代償期肝硬化患者接受了自體BM-MSCs的治療，患者的臨床癥狀和生活質量明顯改善，終末期肝病模型（model of end-stage liver disease,MELD）評分下降。之后國內外的一些臨床研究也發現BM-MSCs和UC-MSCs能夠短期內改善終末期肝病患者的臨床癥狀和生活質量，降低肝硬化患者肝癌的發生率和病死率[16-19]（見表1～2）。針對慢性HCV感染相關的終末期肝病患者，MSCs治療能使Child-Pugh評分以及MELD評分明顯降低，臨床癥狀明顯改善；此外，研究發現MSCs輸注途徑和是否分化為肝細胞樣細胞對治療效果無明顯影響[20-21]（見表1）。該結果可為干細胞輸注途徑和類型的選擇提供參考，但以上結論還需要更多的臨床研究支持。從骨髓獲取MSCs為有創操作，對于肝硬化患者，獲取自體BM-MSCs會增加額外的創傷，應用受到了一定的限制。而應用UC-MSCs對供者和受者無額外的有創操作，且來源廣泛，細胞質量可控，倫理限制較少，故目前在臨床研究中應用較為廣泛。

經G-CSF骨髓動員后獲取的CD34+BMSCs也是臨床研究常用的干細胞類型。研究人員通過G-CSF進行骨髓動員后獲取一定量外周血，再通過免疫磁珠分離等方法獲得適宜數量的CD34+BMSCs，后經肝動脈、脾靜脈或門靜脈等回輸入患者體內，研究結果顯示患者耐受性良好，序貫器官衰竭估計（sequential organ failure assessment,SOFA）評分均明顯下降，血清ALB水平升高，血清TBIL和ALT水平下降，國際標準化比值（international standarization ratio,INR）恢復正常，臨床癥狀得到改善，并有效的延緩了肝性腦病、肝腎綜合征和敗血癥等終末期肝病相關并發癥的發展進程，生存率明顯提高[22-26]（見表3）。另外，針對未經動員的BMSCs的安全性和有效性，國內外也開展了相關臨床研究，結果顯示安全性良好，患者未出現嚴重不良反應，肝臟一過性彈性明顯增強，體積逐漸恢復，肝功能和臨床癥狀明顯改善[27-32]（見表4）。

針對酒精性肝硬化，有開展自體BM-MSCs治療的臨床研究，結果顯示轉化生長因子-1（transforming growth factor,TGF-1）、I型膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）等肝纖維化相關蛋白的表達減少，肝功能明顯改善和Child-Pugh評分顯著降低，無明顯不良反應；肝臟病理顯示：肝臟膠原的比例顯著下降，肝臟組織結構明顯改善[33-36]（見表1）。應用G-SCF動員的BM-MSCs治療，肝臟病理也顯示：肝損傷部位巨噬細胞浸潤增多，炎癥和再生途徑相關基因表達上調[37]。應用G-CSF動員的BMSCs治療，患者耐受性較好，Child-Pugh評分、MELD評分以及SOFA評分均明顯下降，肝功能明顯改善，預后顯著改善[23-24，38-39]（見表4）。

隨著對干細胞治療機制的研究，干細胞免疫調節功能越來越受到關注，已成為治療炎癥性或自身免疫性疾病的重要依據。如經G-CSF動員獲得的CD34+BMSCs可以改善自身免疫性肝病患者肝功能，促進ALB、INR、ALT和TBIL等指標恢復正常[23，37]（見表3）。此外，Liang等[40]應用UC-MSCs治療自身免疫性疾病[原發性干燥綜合征、原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis,PBC）、混合性結締組織病、系統性硬化征、類風濕性關節炎等]導致的肝硬化，結果顯示安全性好，在隨訪的2年內患者肝功能明顯改善（見表3）。有兩項分別應用BM-MSCs和UC-MSCs治療PBC患者的研究結果顯示，患者生活質量明顯改善，血清中ALT、AST、γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyltransferase,γ-GT）和血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的水平均明顯下降，外周血中CD4+CD25+Foxp3+T 細胞和IL-10水平均明顯上升[41-42]（見表1～2）。但Mohamadnejad等[15]通過肝動脈回輸BM-MSCs分別治療了1例PBC和1例自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）導致的失代償期肝硬化，發現患者雖然肝功能有一定程度的改善，但是出現了腎衰竭和肝腎綜合征等并發癥（見表1）。該研究團隊的另一項臨床研究通過外周靜脈輸注BMSCs治療4例自身免疫性肝病和2例PBC患者，結果發現患者的臨床癥狀不僅沒有改善，而且出現了2例死亡事件[40]（見表3）。這一結局提示外周靜脈輸注BMSCs對自身免疫性肝病患者可能是不利的，因此，BMSCs治療AIH的有效性和安全性還須要進行更大樣本量研究來評估。

表1 MSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結果Table 1 Clinical study protocols and main results about MSCs in treatment of end-stage liver disease

表2 UC-MSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結果Table 2 Clinical study protocols and main results about UC-MSCs in treatment of end-stage liver disease

表3 G-CSF動員的BMSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結果Table 3 Clinical study protocols and main results about BMSCs mobilized by G-CSF in treatment of end-stage liver disease

針對藥物、遺傳代謝性疾病（例如肝豆狀核變性、酪氨酸血癥等）、其他多因素合并以及不明原因導致的肝衰竭，干細胞治療也取得了不錯的成效。如應用自體骨髓單個核細胞移植、G-CSF動員的骨髓CD34+干細胞或BM-MSCs等，通過肝動脈或門靜脈回輸方式治療上述原因導致的肝衰竭，結果顯示安全性好，患者肝功能均明顯改善，Child-Pugh、MELD 評分明顯下降[24，28，30，33]（見表1～2，4）。

表4 未經動員的BMSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結果Table 4 Clinical study protocols and main results about unmobilized BMSCs in treatment of end-stage liver disease

4 結 語

總之，干細胞治療終末期肝病的臨床研究取得了很大進展，但目前的臨床研究還存在不足之處，例如：大部分是單中心、小樣本的臨床研究，且研究方案各異、評價指標不一致等。同時，如何獲得穩定、質量可控、能夠滿足臨床需求的干細胞，怎樣確保干細胞制品的有效性和安全性，細胞治療的適應證、禁忌證如何，如何有效評估其安全性和有效性，干細胞最佳類型、最小輸注數量和最佳輸注途徑、最佳治療時機等問題尚待解決。目前，我國已頒布了《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》，干細胞臨床研究已實行臨床研究機構備案和臨床研究項目備案的雙項備案制，在此制度的規范管理下，干細胞臨床研究將會得到不斷深入和有序的發展，干細胞治療終末期肝病的臨床應用指日可待。