CYP24A1基因多態性與中國漢族女性乳腺癌關系的病例對照研究及meta分析

賀寶霞，陳金花，宋文憑，張文周

(鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院 藥學部，河南 鄭州 450008)

維生素D水平與乳腺癌發生發展的關系備受關注[1-2]。1α，25-二羥維生素D3[1α，25-dihydroxyvitamin D3，1α，25(OH)2D3]具有較強的抗腫瘤作用，不僅能抑制腫瘤細胞增殖，還能誘導細胞分化與凋亡。研究發現，細胞色素P450 24A1(cytochrome P450 24A1，CYP24A1)是體內活性維生素D進行生物轉化的關鍵酶[3]。CYP24A1基因為候選致癌基因[4]。研究表明，CYP24A1基因多態性可以被作為判斷非小細胞肺癌預后的指標之一[5-6]。CYP24A1基因表達水平也可能成為評估肺腺癌和直腸癌預后的指標[7-8]。CYP24A1存在基因多態性，并且這些多態性可能影響大腸癌的發生和預后[9]。本研究探討CYP24A1rs6068816(C>T)多態性與中國漢族女性乳腺癌易感性的關系，并通過meta分析評價rs6068816(C>T)多態性與乳腺癌的關系，旨在為有關中國漢族女性乳腺癌易感性的病因學研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 病例對照分析

1.1.1一般資料 收集2012年1月至2016年12月鄭州大學附屬腫瘤醫院收治的674例中國漢族女性乳腺癌患者(病例組)和健康體檢中心672例健康體檢者(對照組)的全血標本。本研究經過鄭州大學附屬腫瘤醫院(河南省腫瘤醫院)醫學倫理委員會批準后進行。所有受試者知曉研究內容并簽署知情同意書。入選病例組的標準：經病理診斷為乳腺癌的中國漢族女性患者。入選對照組的標準：與病例組年齡相匹配的健康女性，經B超和鉬靶X線排除乳腺癌。病例組和對照組的排除標準：(1)合并內分泌系統疾病、其他腫瘤、全身代謝疾病或其他嚴重疾病；(2)從事放射性照射職業；(3)主動或被動吸煙；(4)長期服用外源性雌激素。

1.1.2CYP24A1基因多態性檢測

1.1.2.1試劑與儀器 全人血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根生物公司；MgCl2、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)和Hotstar Taq酶均購自Qiagen公司(德國)；質譜儀、MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀、Spectrochip芯片、MassARRAY RT軟件系統(版本號3.0.0.4)、MassARRAY Typer軟件系統(版本號3.4)，均購自Sequenom公司(美國圣地亞哥)；引物由上海英駿生物公司合成。

1.1.2.2檢測過程 采用試劑盒提取基因組DNA，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)檢測基因分型。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)：反應體系5 μL，包括水1.9 μL，PCR緩沖液0.5 μL(含20 mmol·L-1MgCl2)，25 mmol·L-1MgCl20.4 μL，25 mmol·L-1dNTP 0.1 μL，Hotstar Taq酶0.1 μL，PCR引物1 μL和 DNA樣本1 μL；反應程序為94 ℃預變性15 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環，最后72 ℃延伸3 min。堿性磷酸酶去磷酸化：人血清淀粉樣蛋白P(serum amyloid P，SAP)緩沖液0.17 μL，SAP酶0.3 μL和ddH2O 1.53 μL；反應程序為37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。單堿基延伸反應：ddH2O 0.62 μL，iPLEX緩沖液0.2 μL，終止混合物0.2 μL，延伸引物0.94 μL，iPLEX酶0.04 μL和PCR純化產物7 μL；反應程序為94 ℃預變性30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，共40個循環，最后72 ℃延伸3 min。樹脂除鹽純化，SpectroCHIP芯片點樣。Mass Spectrometry檢測，使用Typer 4.0軟件分析完成基因分型。

1.1.3統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件處理數據。采用Pearson’sχ2檢驗進行基因型頻率及等位基因頻率比較和Hardy-Weinberg平衡分析。P<0.05為差異有統計學意義。

1.2 meta分析

1.2.1文獻檢索 以“乳腺癌”“基因多態性”“CYP24A1”和“rs6068816”為關鍵詞檢索中文數據庫包括中國知網、維普和萬方數據庫；以“breast cancer”“breast carcinoma”“genetic polymorphisms”“gene polymorphism”“CYP24A1”“rs6068816”為檢索詞檢索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等外文文獻數據庫，時間截止至2020年6月30日。

1.2.2文獻納入和排除標準 (1)納入標準：①有關CYP24A1rs6068816多態性和乳腺癌易感性關系的病例對照研究；②研究樣本量明確，有相應基因型的頻數分布或優勢比(odds ratio，OR)值，或根據提供的數據能夠計算出頻數分布的文獻。(2)排除標準：①非多態性研究的文獻；②非rs6068816位點與乳腺癌易感性關系的研究。

1.2.3統計學方法 采用RevMan 5.3軟件進行meta分析。采用χ2檢驗分析納入文獻的異質性。若各研究間不存在異質性(I2≤50%)，采用固定效應模型進行統計分析；若各研究間存在異質性(I2>50%)，采用隨機效應模型進行統計分析。利用Begg’s檢驗繪制漏斗圖，根據漏斗圖的對稱性來檢測所納入文獻是否存在發表偏倚。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例對照研究

2.1.1一般資料 兩組年齡、體質量指數、絕經率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組和對照組基本情況比較

2.1.2CYP24A1rs6068816多態性與乳腺癌的易感性關系CYP24A1rs6068816 CC、CT和TT基因型在病例組的分布頻率分別為40.1%(270/674)、52.5%(354/674)和7.4%(50/674)，在對照組的分布頻率分別為 37.5%(252/672)、51.9%(349/672)和10.6%(71/672)。病例組和對照組CYP24A1rs6068816位點基因型分布(CC+CT與TT)比較，差異有統計學意義(χ2=4.074，P=0.046)。

2.2 meta分析

2.2.1文獻概況 共收集到相關文獻4篇，最終納入已發表文獻2篇[10-11]，合并本研究上述結果后進行meta分析。meta分析中正常對照組3 094例，乳腺癌組2 355例。納入meta分析文獻的一般資料見表2。

表2 納入meta分析文獻的基本特征(n)

2.2.2meta分析結果 已納入文獻不存在異質性(P>0.05)，采用固定效應模型進行分析。T等位基因相對于C等位基因是乳腺癌的保護因素(P<0.05)，見圖1。突變純合型TT與野生純合型CC比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。顯性遺傳模型TT與CC+CT基因型比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。已納入文獻不存在發表偏倚。

圖1 CYP24A1 rs6068816與乳腺癌易感性的meta分析(T等位基因與C等位基因)

圖2 CYP24A1 rs6068816與乳腺癌易感性的meta分析(TT基因型與CC基因型)

圖3 CYP24A1 rs6068816與乳腺癌易感性的meta分析(TT基因型與CC+CT基因型)

3 討論

CYP24A1屬于細胞色素P450超家族成員，主要作用是催化25-羥基維生素D3和1，25-二羥基維生素D代謝為24-羥基化產物，導致維生素D失活[3]。CYP24A1在腎臟和胃腸道黏膜表達量較高。CYP24A1抑制劑能夠增強1α,25(OH)2D3的抗腫瘤細胞增殖作用。

近年來，多個研究報道CYP24A1遺傳多態性與多種腫瘤的易感性關系，如肺癌、乳腺癌以及結直腸癌等[9-12]。有研究表明CYP24A1mRNA的表達水平與乳腺癌有關[13]。在乳腺發育和妊娠相關的乳腺發育中，CYP24A1起關鍵作用[14]。CYP24A1在多種腫瘤細胞中高表達，可以減弱1，25(OH)2D3的抗腫瘤活性，這可能是CYP24A1影響腫瘤發生的機制之一[15]。Sadeghi等[9]研究發現，CYP24A1rs4809960 CC基因型能夠降低結直腸癌的發病風險。CYP24A1rs6068816 T等位基因攜帶者患肺癌的風險相對較低[16]。CYP24A1rs2762934、CYP24A1rs6068816與肺癌發病風險有較強的相關性[12]。有關CYP24A1rs2585428(G>A)、rs4809960(T>C)、rs6022999(A>G)和rs6068816(C>T)的研究結果顯示，ATGC單倍型大腸癌的發病風險顯著降低[17]。CYP24A1rs6068816的多態性與中國人群胃癌易感性有關[18]。由本研究結果可知，rs6068816(C>T)突變可能會影響CYP24A1的活性，導致體內活性1，25(OH)2D3水平改變，抗腫瘤作用減弱，進而影響腫瘤的發生。CYP24A1多態性在不同人群中的分布和遺傳特征不同。本研究與Reimers等[10]研究結果一致，與Clendenan等[11]研究結果相反。

本研究對rs6068816多態性與乳腺癌的易感性進行了meta分析，結果依然顯示rs6068816 TT等位基因為乳腺癌的保護因素。有關rs6068816多態性與乳腺癌的文獻較少，meta分析僅納入檢索文獻2篇[10-11]及本研究中病例對照分析的數據。仍需擴大樣本量并選取多個種族樣本進一步證實CYP24A1rs6068816多態性與乳腺癌的易感性關系，并分析rs6068816多態性影響CYP24A1酶活性的機制，為乳腺癌的預防和治療提供參考依據。