低濃度含鉛細顆粒物暴露大鼠體內生物轉運研究

夏棟林 仇 昀 王鄉兒 陳 超 張小鑫 袁善美 顧海鷹 胡 勇

(1.南通大學 公共衛生學院，江蘇 南通 226019；2.南京大學 現代工程與應用科學學院，南京 210023；3.南通職業大學 江蘇 南通 226019)

前言

大氣細顆粒物(Particulate Matter，PM)是大氣中多種污染物的富集載體，成分復雜，尤其是存在許多重金屬(如鉛)。這些重金屬能夠以大氣細顆粒物的形式通過呼吸途徑進入人體，并長時間沉積。因這些顆粒物難以被生物降解，從而在人體中長期不斷向血液釋放，甚至可以穿過血腦屏障對中樞神經系統造成影響。特別是長時間干擾人體內蛋白質及酶的功能，造成慢性損傷。

鉛是人類環境中接觸最頻繁的有毒重金屬污染之一[1]。隨著鉛的廣泛應用，鉛污染的暴露風險無處不在，如含鉛塑料制品作為食品接觸材料、可再生資源中殘留的鉛等。調查發現，我國成人血鉛水平高于發達國家，兒童血鉛水平更是達到了70 μg/L左右，要比發達國家高出2～3倍[2]。自2000年我們全面禁止銷售含鉛汽油，空氣中的鉛污染得到了巨大改善。但隨著我國汽車保有量的快速增長，汽車尾氣中的鉛細顆粒物污染形成的低濃度、長時間暴露危險不容忽視。鉛在顆粒物狀態更容易穿透生物體內的細胞膜進入體內，并且在體內產生累積毒性效應[3-7]。研究發現低濃度鉛暴露會隨著暴露時間的增加，導致越來越高的中樞神經系統疾病發生率、孕產婦流產和發育畸形等問題[8-9]，甚至造成嬰幼兒智力、記憶力、神經行為的障礙[10]。但目前低濃度、長期含鉛細顆粒物吸入暴露后，在體內生物轉運及體內分布并沒有相關報道。因此，本文以含鉛細顆粒物為研究對象，模擬長期、低濃度暴露，研究其在大鼠體內的吸收、分布與代謝，為含鉛細顆粒物的毒性研究提供數據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AA-6800原子吸收光譜儀(日本島津公司)；HOPE-MED 8050 動式染毒控制系統(天津開發區合普工貿有限公司)；SFC-3BT呼吸粉塵采樣器(常州德杜精密儀器有限公司)；大氣顆粒物PM2.5采樣器(TAS)(培德國際有限公司)；JY2500汽油發動機(福建省佳友機電)；馬爾文粒度儀(Zetasizer Nano ZS 90)；汽油為中國石化92#汽油；硝酸鉛購自西隴化工股份有限公司。

1.2 模擬環境的建立

如圖1所示，將汽油發動機尾氣接入動靜式染毒柜中：汽油發動機發動引擎后(轉速3 600 r/min)，排放的尾氣經排氣軟管直接接入染毒柜，通過補充清潔空氣來控制染毒柜中PM2.5的濃度，將實驗動物放置染毒柜中進行染毒。利用大氣顆粒物PM2.5采樣器采集模擬環境中的細顆粒物，隨后消化，并利用原子吸收光譜儀測定鉛濃度、利用馬爾文粒度儀進行粒徑分析。

圖1 模擬環境系統示意圖Figure 1 Schematic of simulation environment.

1.3 實驗分組與處理

雄性SD大鼠30只，體重(180±20) g，由南通大學實驗動物中心提供。將實驗動物隨機分為3組：對照組、經口染毒組(灌胃)、吸入染毒組。每組10只大鼠。對照組采用生理鹽水灌胃。經口染毒組以硝酸鉛為鉛來源。吸入染毒組以模擬環境進行染毒，每天10 h，連續染毒28 d。

1.4 樣本的收集

染毒后，將實驗動物飼養于代謝籠中，12 h開始第一次收集尿液和糞便，之后于1、2、3、7、10、14、21、28 d收集尿液和糞便；染毒后72 h開始第一次眼眶取血，之后于7、10、14、21、28 d采集血樣，檢測血鉛含量變化。

1.5 樣品處理

按照姚朝英等[11]報道的方法，將血液、尿液、糞便或者烘干的臟器組織放入燒杯中，按1 g組織或1 mL 液體加入混合酸(硝酸∶高氯酸=5∶1)，室溫過夜消化，直至乳液澄清。次日，將燒杯置于電熱板上加熱煮沸，直到白煙冒盡，消解完全后即得白色殘渣。用去離子水分3次沖洗燒杯內的白色殘渣，利用10 mL試管定容沖洗液，搖勻，待測，同時做平行空白。

1.6 鉛濃度測定

采用原子吸收光譜法測定鉛的濃度，儀器工作參數為波長283.3 nm，狹縫0.7 nm，燈電流10 mA，積分時間5 s，乙炔流量1.2 L/min，空氣流量7.5 L/min，燃燒器高度6 mm，氘燈背景校正。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 構建的模擬環境含鉛細顆粒物情況

所有的SD大鼠飼養于屏障系統中，對該屏障系統空氣質量進行監測，結果如圖2所示，清潔空氣粒子細顆粒物濃度為(7.69±3.21) mg/m3，鉛濃度為(0.12±0.03) μg/m3；粒徑范圍為(90.39±45.01) nm。構建的低濃度鉛污染環境中，PM2.5濃度高達(515.16±8.79) mg/m3，鉛濃度為(7.05±0.83) μg/m3，粒徑范圍為(271.20±148.70) nm。

圖2 清潔空氣和發動機尾氣構建的低濃度鉛污染環境指標比較。(A)細顆粒物濃度，(B)鉛濃度，(C)清潔空氣，(D)低濃度鉛污染環境粒徑分布Figure 2 The environmental indicators of the clean air and the microenvironment of low concentration lead.(A)The concentration of PM2.5，(B)The concentration of Pb，(C)Clean air，(D)The particle size distribution low concentration of lead.

2.2 各組給藥濃度

對構建的模擬環境中細顆粒物中的鉛濃度進行檢測。按照大鼠氣體呼吸量為(50～101 mL/min)，由此估計汽車尾氣組每天染毒10 h，吸入的鉛含量約為(0.21～0.42) μg/d。因此，陽性對照組(經口染毒組)為了達到相同的鉛攝入量，以硝酸鉛為替代，進行灌胃，濃度采用0.42 μg/d，連續28 d。

吸入染毒組按照鉛濃度為(0.12±0.03) μg/m3染毒，每天10 h，連續28 d。

2.3 血鉛、鉛代謝及體重變化

鉛進入體內后將進入血液循環。見圖3A，吸入染毒組和經口染毒組的血鉛濃度隨著染毒時間延長而逐步上升，直到染毒結束28 d達到峰值。比較經口染毒組和吸入染毒組的血鉛變化，可以看出，經口染毒組鉛入血速度更快。但染毒在28 d結束后，繼續觀察血鉛的變化，可以發現：經口染毒組的血鉛濃度迅速下降。這可能是由于染毒結束后，不再有鉛從腸道吸收入血。但血鉛中濃度依然比對照組高，這主要是由于轉移到骨、臟器等內的鉛向血液中釋放。而吸入染毒組的血鉛從28 d后明顯要高于經口染毒組，這與前期染毒過程中在肺內蓄積了大量的鉛后，逐步向血液釋放導致，這一點可以從對各組肺內的鉛濃度進行檢測結果得到驗證。

重金屬的代謝主要是通過糞便及尿液。圖3B是各組56 d內大鼠糞鉛含量的變化。經口染毒組糞鉛含量從染毒第1周開始到染毒結束(4周)，糞鉛含量達到3.0 μg/g以上，遠高于吸入染毒組的1.56～2.13 μg/g，二者具有統計學差異(P<0.01)。而染毒結束后，糞鉛濃度迅速下降。圖3C是56 d內尿鉛的變化，吸入染毒組的尿鉛濃度迅速上升，直到染毒結束。經口染毒組尿鉛雖有上升，但要小于吸入染毒組。并且同糞鉛濃度曲線相似，染毒結束(28 d)后，尿鉛濃度迅速下降。結合圖3B、3C的結果，可以看出經口途徑、吸入途徑染毒均主要是通過糞便排泄，另外尿液排泄是吸入染毒后排泄的另一條主要途徑。

三組大鼠的平均體重結果如圖3D所示。56 d內陰性對照組體重迅速增加，吸入染毒組和經口染毒組體重增加緩慢。與對照組相比，不論是經口染毒組還是吸入染毒組，與對照組比較均有統計學差異(P<0.01)。

圖3 染毒后血鉛、糞鉛、尿鉛濃度和體重變化。1～28 d為染毒期(28 d)，29～56 d為觀察期。(A)血鉛濃度變化；(B)糞鉛濃度變化；(C)尿鉛濃度變化；(D)體重變化曲線。(吸入染毒組與經口染毒組比較，**P<0.01)Figure 3 The curve of Pb concentration in the blood，feces，urinary and the change of body weight.The rats were exposed to PM2.5 for 28 d and following 28 d observation period.The curve of (A) Blood lead，(B) Fecal lead，(C) Urinary lead，(D) The change of body weight.(**P<0.01，significant compared with oral administration group).

2.4 鉛的體內分布

由染毒后血鉛、鉛代謝及體重變化，推測吸入染毒組鉛在體內蓄積量大。由此我們對染毒期內肺部鉛濃度變化進行檢測。如圖4A所示，隨著染毒時間的延長，吸入染毒組肺內鉛明顯高于其他組，有統計學差異(P<0.01)。說明大量的鉛細顆粒物能夠在肺內沉積。56 d后，各組鉛在各臟器的分布，如圖4B所示。經口染毒組和吸入染毒組各臟器鉛含量均有所增加，且肺、腎、脾及心內鉛含量增加，與對照組相比，有統計學意義(P<0.01)。染毒后經過28 d，吸入染毒組的肺鉛仍然遠遠高于經口染毒組肺鉛含量(P<0.01)。圖4B顯示了各組骨鉛含量的變化，吸入染毒組股骨、尾骨、肋骨鉛含量均高于對照組及經口染毒組，有統計差異(P<0.01)。鉛在骨骼組織分布順序為：肋骨>股骨>尾骨。

結合圖3、4的結果，可以看出吸入染毒組在體內的蓄積量比較大，因此對殘留鉛的比例進行計算，如圖4D，經過28 d的染毒，28 d正常飼養后，經口染毒組鉛的殘留量是18.98%±4.56%，而吸入染毒組鉛的殘留量高達33.71%±7.38%，遠高于經口染毒組(P<0.01)。

圖4 鉛的體內分布。(A)染毒期內肺鉛濃度變化；(B)56 d后各組重要臟器鉛含量；(C)56 d后骨鉛濃度；(D)吸入染毒組與經口染毒組鉛殘留量比較，**P<0.01Figure 4 In vivo distribution of Pb.(A) The change of Pb concentration in lunge during inhalation exposure.(B) The concentrations of Pb in major organs in each group after 56 d.(C) the bone level of lead after 56 d.(D) The residue of Pb in the oral exposure group，and the inhalation group，**P<0.01.

3 討論

重金屬鉛的暴露呈現細顆粒化及低濃度化，雖然目前規定的血鉛閾值水平為0.1 mg/mL[12]，但有證據表明鉛的安全閾值無法確定。因此必須考慮任何鉛暴露風險因素，特別是不同暴露途徑與時間[13-14]。暴露途徑的不同，意味著金屬在體內的吸收和組織分布不同，對機體的危害不同。本實驗比較了不同暴露途徑(亞急性經口和吸入毒性實驗)對大鼠進行鉛染毒，結果發現在吸入染毒和經口染毒組體重均增加緩慢，且吸入染毒組體重明顯下降，可能與吸入染毒后，大量鉛在肺內蓄積，并不斷向血液、臟器等轉移，從而使得大鼠處在高鉛污染狀態，影響了大鼠的生長發育。

在低濃度下持續暴露于鉛導致其在體內積聚，并分布于各個器官如：肝臟、腎臟、肺臟、胰腺、脾臟，最終累積在骨骼中[15]。鉛暴露人群的尸體解剖研究也表明，在軟組織中，肝臟是儲存最多的器官(33%)，其次是腎臟。對兒童血鉛進行分析發現，鉛在骨骼、腎臟和肺臟中含量較高[16]。也有人用同位素實驗證明了鉛在大鼠體內的分布，主要在肝和腎臟中，睪丸、心臟、腦中的鉛含量較低，但并未對骨骼鉛分布情況進行研究。本實驗研究了不同暴露途徑(亞急性經口和吸入毒性實驗)染毒后大鼠體內血鉛、糞鉛、尿鉛、臟器鉛、骨鉛含量的變化，在大鼠所有器官和組織中都有發現鉛的分布。其中吸入染毒后，大量的鉛以細顆粒物的形式進入體內，在肺內大量蓄積。

鉛的代謝主要通過腎過濾和尿糞排泄，少量鉛也排泄在汗液，頭發和指甲，剩余分布到軟組織和骨。本研究中發現經口染毒組中81.02%的鉛可以通過尿糞排泄掉，剩余部分才緩慢入血；而吸入染毒組的鉛可以通過尿液排泄，尿糞總排泄率約為66.29%，導致大量在肺內沉積，進而加重了骨沉積。

4 結論

針對食品接觸性塑料制品、可再生資源、汽車尾氣等低濃度鉛暴露，開展了大鼠低濃度含鉛細顆粒物暴露體內生物轉運研究。通過對比吸入染毒及經口染毒后體內分布、排泄，得出含鉛細顆粒物吸入更容易在體內(肺)蓄積，具有入血速度快、肺內沉積量大的特點。最終主要在股骨和肋骨內蓄積，且排泄慢，體內鉛殘留含量更高，危害更大。因此，低濃度、長時間含鉛細顆粒物的環境暴露對人體的危害需引起人們重視。