Stargardt病一家系致病基因突變位點的研究與分析付何云

郭光 王文玲 李才銳

Stargardt病又稱Stargardt黃斑營養(yǎng)不良，全球發(fā)病率約為1/10000，多于青少年期發(fā)病，平均年齡為15.2歲[1，2]。該病在遺傳性黃斑營養(yǎng)性疾病中較常見，檢測顯示多數(shù)為ABCA4 基因突變。該基因突變會造成由它編碼的視桿細胞外節(jié)段表達的特異的ATP結合盒轉運蛋白功能異常。該功能異常會造成視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)積累全反式視黃醛，全反式視黃醛再轉化為A2E，脂褐素的主要組成成分是A2E，脂褐素的毒性會損害RPE并且遮蓋光感受器[3，4]。本研究對Stargardt病一家系致病基因突變位點進行篩查并分析。

資料與方法

一、一般資料

6名Stargardt病家庭成員(1，2患者，4基因攜帶者)。獲得所有受檢者知情同意后，由同一醫(yī)生，在安陽市眼科醫(yī)院對所有受檢者進行至少一次檢查。

二、方法

臨床采集病史，裂隙燈顯微檢查，驗光，應用1%的托吡卡胺滴眼液擴瞳后進行眼底檢查，熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)和頻域相干光層析成像術(spectral domain optical coherence tomgography，SD-OCT)、視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)檢查。采集6名受檢者外周血5 ml， EDTA抗凝管中封存，送北京康旭醫(yī)學檢驗所行全外顯子Slim檢測，確定基因分型和突變。提取基因組DNA，構建基因組文庫，測序。所有的研究都經(jīng)過了安陽市眼科醫(yī)院審查委員會的批準。

三、診斷依據(jù)

雙眼中心視力進行性下降，配鏡提高不明顯或無法提高；黃斑區(qū)營養(yǎng)不良，牛眼征，家族性發(fā)病，基因檢測。

結 果

一、基本資料

6例受檢者中，2例患者。1例攜帶者，患者1，女性，年齡19歲；患者2，男性，10歲；攜帶者，女性，年齡43歲。家族系見圖1，臨床信息見表1。通過檢查，發(fā)現(xiàn)6位受檢者的眼前段和眼壓基本正常。患者1雙眼矯正視力0.3，患者2雙眼矯正視力0.3。

圖1 Stargardt家系圖

表1 2例患者及1例攜帶者基本信息

隨訪半年，患者1視力基本穩(wěn)定在矯正視力0.3。眼底彩照見圖2A、B，SD-OCT圖2C、D；患者2矯正視力較之前稍差，矯正0.2，患者眼底彩照見圖3A、B，F(xiàn)FA圖3C、D和SD-OCT圖3E、F。檢測到的黃斑中心凹結果可見異常。已發(fā)病者，視乳頭邊界清，視網(wǎng)膜血管正常，雙眼黃斑部呈一類橢圓形的萎縮區(qū)，同時黃斑區(qū)色素紊亂。

圖2 患者1眼底像及SD-OCT檢查

圖3 患者2眼底像及FFA和SD-OCT檢查

二、DNA測序結果

患病者1、2和攜帶4者均檢測到ABCA4基因異常.共檢測到8個突變,見表2。檢測出致病基因突變8處，ABCA4 基因c.1760+2T>G，USH2A 基因c.7068T>G和c.9340C>T，F(xiàn)ZD4 基因c.205C>T，IMPDH1 基因c.1405+9A>G，PRIMPOL 基因c.265T>G，RB1 基因c.2212-9C>A，TSC2 基因c.856A>G。患者外祖母、外祖父和父親無發(fā)病無突變。母親含有3個突變，姐姐病情較弟弟輕，8個突變中含有4個，病情重的弟弟含有8個突變，姐弟兩人前三個基因突變遺傳均源于母親。測序圖見圖4。(以下數(shù)據(jù)對應人類基因組GRCh37/hg19版本)：

表2 本研究中發(fā)現(xiàn)的突變基因的突變形式

圖4 Stargardt病基因測序圖

(1).ABCA4基因，轉錄本NM_000350， c.1760+2T>G，具體位置位于染色體chr1:94528666；

(2).USH2A 基因，轉錄本 (NM_206933)，c.7068T>G；具體位置位于染色體chr1:216138711；

(3).USH2A 基因，轉錄本 (NM_206933)，c.9340C>T；具體位置位于染色體chr1:216011364；

(4)FZD4 基因，轉錄本(NM_012193)，c.205C>T，具體位置位于染色體chr11:86665923；

(5)IMPDH1 基因，轉錄本(NM_000883)，c.1405+9A>G，具體位置位于染色體chr7:128035176；

(6)PRIMPOL 基因， 轉錄本(NM_152683)，c.265T>G，具體位置位于染色體chr4:185580578；

(7)RB1 基因，轉錄本(NM_000321)，c.2212-9C>A，具體位置位于染色體chr13:49039125；

(8)TSC2 基因，轉錄本(NM_000548)，c.856A>G，具體位置位于染色體chr16:2108755。

討 論

Stargardt 病主要損害中心視力、視野，雙眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮層和神經(jīng)上皮進行性萎縮，組織病理學改變可以發(fā)現(xiàn)RPE細胞層脂褐質沉積和感光細胞的丟失和死亡。95%以上的Stargardt 病與ABCA4基因(OMIM：601691；GenBank：NG_009073.1)的異常有關[5，6]。ABCA4基因位于染色體1p22，全長約8kb，含50個外顯子，cDNA長度為6705bp，它編碼2235個氨基酸，位于視網(wǎng)膜視桿細胞外段的視盤膜中。目前在ABCA4基因中，已發(fā)現(xiàn)約900種基因突變。在我國的大樣本研究中，基因突變最多的為錯義突變(55.1%)，其次為剪切突變(17.6%)，移碼突變(15.4%)，無義突變(11.8%)[7]。同時，PRPH2、VMD2、ELOVL4和PROM1基因突變可以起部分Stargardt 病或者類似臨Stargardt 病床表型的眼病[8]。

已知的Stargardt 病的致病基因，有些基因也會導致同一重疊的臨床表型，例如，ABCA4 基因是 Stargardt 病 1 型、視錐桿細胞 營養(yǎng)不良 3 型、視網(wǎng)膜黃色斑點沉著、早發(fā)性嚴重視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜色素變性 19 型的致病基因，為常染色體隱性遺傳方式(AR)。臨床表型多樣和致病基因復雜導致 Stargardt 病容易漏診和誤診。臨床檢查和基因檢測有效結合有利于診斷 Stargardt 病。

在國際上，Tomas R的研究中發(fā)現(xiàn)了ABCA4染色體上的W663X和A1038V基因的混和突變[9]，錯義突變A1038V是Tomas R報道的新發(fā)“溫和”突變。w663x的致病突變曾被報道[10]。ABCA4基因最常檢測到的突變之一是雜合等位基因L541P/A1038V。當ABCA4染色體在體外時，缺乏L541P[11，12]，A1038V無法對ATP酶產(chǎn)生影響。G1961E的錯義突變是ABCA4基因檢測中最常見的突變，并被報道為溫和表型[12-14]。本研究中兩患者均為青少年，矯正視力在0.3左右，ABCA4基因考慮c.1760+2T>G突變?yōu)闇睾托汀．斎灰膊慌懦S著年齡的增大，患者視力漸進性下降，臨床上我們還要進一步隨訪和觀察。

本研究中發(fā)現(xiàn)了8個基因突變，其中c.1760+2T>G位于，雜合變異，內(nèi)含子Intron12，雖已經(jīng)有文獻曾報道Stargardt 病的該基因突變，但該突變未引起氨基酸變化，所以其致病性還有待進一步研究。c.7068T>G位于USH2A 基因，雜合變異，外顯子Exon37，造成第2356號氨基酸由Asn變?yōu)長ys(p.Asn2356Lys)，為錯義變異。c.9340C>T位于USH2A 基因，雜合變異，外顯子Exon47，造成第3114號氨基酸由Pro變?yōu)镾er(p.Pro3114Ser)。USH2A 基因突變可造成視網(wǎng)膜色素變性，Usher綜合征2A型(遺傳性耳聾-視網(wǎng)膜色素變性綜合征)。USH2A 基因的致病突變，目前匯報的有近800個，USH2A 基因含有72個外顯子，編碼5202個氨基酸。c.205C>T位于FZD4 基因，雜合變異，外顯子Exon1，造成第69號氨基酸由His變?yōu)門yr(p.His69Tyr)。FZD4 基因可引起滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變I型、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。c.1405+9A>G位于IMPDH1 基因，雜合變異，內(nèi)含子Intron13，未引起氨基酸變化。IMPDH1 基因可引起Leber先天性黑朦II型，視網(wǎng)膜色素變性10型。c.265T>G位于PRIMPOL 基因，雜合變異，外顯子Exon4，造成第89號氨基酸由Tyr變?yōu)锳sp(p.Tyr89Asp)。PRIMPOL 基因可引起近視。c.2212-9C>A位于RB1 基因，雜合變異，內(nèi)含子Intron21，未引起氨基酸變化。RB1 基因可導致體細胞突變(膀胱癌、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤)。c.856A>G位于TSC2 基因，雜合變異，外顯子Exon10，造成第286號氨基酸由Met變?yōu)閂al(p.Met286Val)。TSC2 基因可導致體細胞突變(局部皮質發(fā)育不良、淋巴管平滑肌瘤病)，結節(jié)性硬化癥2型。

本研究中兩患者其母親含有ABCA4基因和USH2A 基因中的3個突變，但是表型正常。患者1含有8個突變，患者2含有4個突變，考慮兩患者Stargardt 病的發(fā)病可能是多基因作用的結果。Stargardt 病的致病基因除了常見的ABCA4基因突變，也不排除USH2A 基因、FZD4 基因、IMPDH1 基因、PRIMPOL 基因、RB1 基因、TSC2 基因，在以后的研究和臨床診治中，擴大考慮致病基因范圍。本研究拓寬了Stargardt 病的研究范圍，為新的領域的研究提供參考依據(jù)。

該病嚴重危害青少年視力，目前主要的治療方法有營養(yǎng)補充治療，高壓氧治療，尚在研究的基因治療，細胞移植治療，細胞因子治療等。現(xiàn)在臨床上還無有效控制該病進展的療法，但是早期診斷可以給患者提供延緩視力損害的措施，比如減少陽光照射，佩戴墨鏡，經(jīng)常戴帽子等，低視力康復咨詢、組織不必要的過量的維生素A的攝入。本研究為Stargardt 病的研究、為臨床患者的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等提供了提供了分子生物學參考依據(jù)。