基于效應子E38識別與NB-LRR富集測序挖掘抗晚疫病馬鈴薯資源

段艷鳳，文國宏，Armstrong MR，李廣存，金黎平*

（1.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2.甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；3.英國鄧迪大學/詹姆斯赫頓研究所植物科學系，英國 鄧迪 DD2 5DA）

馬鈴薯是世界上繼小麥、玉米和水稻之后的第4大糧食作物，也是中國重要的糧菜飼兼用作物[1]。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病是馬鈴薯生產上最具毀滅性的病害[2]。目前，生產上對晚疫病的防治措施主要應用殺菌劑，不僅會導致抗藥性菌株的產生，還增加了環境污染及對人類健康帶來風險。實踐證明，培育抗病品種是防治晚疫病的根本手段[3]。然而，由于栽培馬鈴薯抗源缺乏，抗病基因（R基因）容易被高度進化的晚疫病菌株克服，致使抗晚疫病育種進程緩慢。因此，尋找優異晚疫病抗源材料，挖掘新的R基因，對于促進馬鈴薯抗晚疫病育種具有重要意義。

致病疫霉基因組容量高達240 Mb，編碼了大量的效應蛋白，其中最大的效應蛋白家族為RXLR類蛋白，大約有560多個[2]。目前，所有被報道的致病疫霉效應蛋白（AVR）均屬于RXLR類蛋白，并且都排列在基因稀疏、重復序列較高的區域，例如AVR1[4]、AVR2[5]、AVR3a[6]、AVR4[7]及AVR-blb2[8]等。目前已經克隆的馬鈴薯晚疫病R基因有近30個，均屬于NB-LRR類抗病基因[9]。基于植物與病菌識別的ETI理論，這些R基因編碼的蛋白可以通過識別致病疫霉中RXLR類AVR蛋白產生過敏性反應（Hypersensitive response，HR），從而使馬鈴薯產生抗病性[10]。效應子組學策略由Vleeshouwers等[11]在2008年提出，即通過效應子與抗病基因的識別鑒別馬鈴薯資源中是否含有潛在抗病基因，該方法大大提高了抗病資源的評價及抗病基因的鑒定和利用效率。

近年來一種基于NB-LRR序列富集測序（Resistance gene enrichment Sequencing，RenSeq）技術發展成熟。該技術可以精確地對植物基因組中NB-LRR基因序列進行進一步注釋，通過該技術研究者們將馬鈴薯基因組中的NB-LRR基因數目從438個增加到了755個[12]。RenSeq技術可以快速有效地對R基因進行定位和分離。Jupe等[12]利用該技術分別以野生種Solanum berthaultii和S.ruiz-ceballosii分離群體為材料，成功鑒定到了上述兩個群體中與晚疫病抗性位點共分離的標記。RenSeq還可以作為一種快速診斷工具（dRenSeq），對通過磁珠富集的片段測序后與已知的R基因進行比對，可以快速確定被檢測的材料是否含有已知的R基因[13]。

本研究所用的晚疫病菌效應子E38由西北農林科技大學實驗室提供，該實驗室在前期研究中發現在馬鈴薯栽培品種‘隴薯12號’中過表達E38可引發過敏性壞死反應（HR），揭示了在‘隴薯12號’中可能存在特異識別E38的抗病基因。本研究以‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’為材料，通過晚疫病抗性鑒定、效應子識別及dRenSeq等分析，并以‘隴薯12號’與‘L05Nsr-j-1’的分離群體為材料，以期解析其抗性遺傳基礎，為‘隴薯12號’的利用及抗晚疫病基因克隆等后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’均為四倍體，F1雜交后代分離群體共計215個單株，以上材料由甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所提供。試管苗在MS培養基（20 g/L蔗糖，5 g/L含維生素MS，8 g/L瓊脂，pH 5.8）上，23℃、16 h/8 h光暗培養兩周后，移植于日光溫室營養缽中生長，期間進行澆水、施肥等日常管理。‘隴薯12號’、‘L05Nsr-j-1’及F1分離群體在移植后4～5周時選取健康、幼嫩完全展開的葉片進行病菌效應子分析。晚疫病菌接種鑒定在移植后8～10周時進行。

1.2 晚疫病菌株及抗性鑒定

用于接種的晚疫病菌株為428-2、T30-4、90128和CN152（表1），其中CN152可以克服很多已知的抗晚疫病基因，包括廣譜抗病基因Rpi-blb1/RB，被稱為“超級生理小種”。晚疫病菌株于液氮保存，待接種時于黑麥培養基上活化。活化的菌株在霉菌培養箱18℃黑暗培養7～14 d，待菌絲長滿培養皿時加適量無菌水于4℃誘導游動孢子3～6 h，利用血球計數器統計游動孢子數量并稀釋到接種濃度，準備接種。

接種方法采用離體葉片法[16]，并略加改動。從植株頂部計起，選取第3～5片展開葉，背面朝上置于雙層濕潤滅菌濾紙上，在每個葉片背面主葉脈兩側各接種1滴濃度為5×104個游動孢子/mL的孢子懸浮液，每滴10μL。接種后將容器封好，置于18℃培養箱內，在每日光照16 h，黑暗8 h，相對濕度100%條件下培養。接種后6～7 d調查發病情況。對于接種的每個菌株，每份材料從3個植株上各選取一個葉片進行接種，每個接種試驗重復3次。本研究以‘CPH1-14’為抗病對照，‘Desiree’為感病對照。

表1 晚疫病抗性鑒定所用菌株Table 1 Isolates used for late blight resistance evaluation

1.3 重組質粒及轉化質粒的鑒定

重組質粒pMDC83-E38由西北農林科技大學實驗室提供；pBINPLUS-R3a和pK7WG2-Avr3a重組質粒由荷蘭瓦赫寧根大學實驗室提供；空載體pMDC83由本實驗室保存（表2）。將以上質粒通過凍融法[17]轉至農桿菌GV3101中。將轉入質粒的農桿菌分別在含有相應抗生素的LB平板培養基上活化，28℃靜置培養2 d。挑取單克隆接入1 mL含有相應抗生素的LB液體培養基，28℃，200 r/min，培養過夜，菌液DNA進行PCR驗證，經過驗證的菌液加20%滅菌甘油保存在-80℃冰箱。

R3a[18]和Avr3a[19]特異引物序列來源于參考文獻，E38和pMDC83引物序列通過軟件Primer premier 5.0設計（表3）。PCR反應體系：菌液DNA模板1μL、上游引物（5μmol）0.3μL、下游引物（5μmol）0.3μL、2×Taq mix 8μL、ddH2O 6.4μL。PCR反應程序：94℃變性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環。第一個循環之前94℃預變性5 min，最后72℃延伸7 min。

1.4 基于農桿菌介導的基因瞬時表達分析(Agroinfiltrationassay)

采用Vossen等[20]的方法，每個植株選取3片幼嫩、健康和完全展開的葉片進行基因瞬時表達分析，設置3次生物學重復。將于-80℃貯存的農桿菌菌液在含有相應抗生素的3 mL LB液體培養基中28℃過夜培養。第2 d，將這些培養物接種到含有相應抗生素的15 mL YEB培養基中（1 L蒸餾水中添加5 g牛肉浸膏、5 g蛋白胨、5 g蔗糖、1 g酵母提取物及2 mL 1 mol MgSO4），另加10μL/L 200 mol乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）及1 000μL/L 1 mol 2-氮嗎啉乙烷磺酸[2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid，MES]，28℃，200 r/min，培養過夜。第3 d，16℃、4 000 r/min離心8 min收集細胞，用MMA緩沖液（1 L蒸餾水中添加20 g蔗糖、5 g MS及1.95 g MES，用NaOH調節pH至5.6，另外添加1 mL/L 200 mol溶于DMSO的AS）重懸浮至OD600達到0.2。將含有R3a和Avr3a基因懸菌液1∶1混合，室溫靜置3 h后，用1 mL無針頭注射器以點注射方式（直徑1 cm左右）在葉片上注射作為陽性對照。空載體pMDC83、農桿菌GV3101為陰性對照。3～4 d后觀察、統計表型。試驗設置3次生物學重復和3次試驗重復。

表2 用于農桿菌瞬時表達的質粒Table 2 Vectors used for agroinfiltration

表3 用于PCR驗證的引物Table 3 Primers used for PCR validation

1.5 基因組DNA提取及d RenSeq分析

采用改良的CTAB法[21]提取‘隴薯12號’及‘L05Nsr-j-1’基 因 組DNA，利 用Nanodrop ND-100型分光光度計檢測DNA的質量及濃度。

dRenSeq分析參考Armstrong等[22]的方法進行。利用‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’的DNA分別構建基因組DNA測序文庫，與標記有NB-LRR基因保守序列的磁珠雜交富集。將雜交上的DNA洗脫，并基于Illumina MiSeq測序平臺測序。將測序的reads與已知的馬鈴薯晚疫病R基因以1%和2%的錯配率進行比對。

2 結果與分析

2.1 ‘隴薯12號’可能含有未知晚疫病抗病基因

利用包括超級生理小種CN152（13_A2型）在內的4個來源不同、毒力不同的晚疫病菌株對‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’進行了接種鑒定。結果如圖1所示，‘隴薯12號’對CN152表現為感病，對90128、T30-4及428-2 3個菌株表現為抗病；‘L05Nsr-j-1’則對4個菌株均表現為感病。結合4個菌株的生理小種類型，推測‘隴薯12號’可能含有晚疫病抗病基因R2、R9或其他抗病基因。

2.2 病原效應子E38可以激發‘隴薯12號’特異的HR反應

目前，已公布的馬鈴薯R基因均是通過識別致病疫霉中一類含有RXLR結構域的效應子從而激發抗病功能。本研究采用效應子E38分別在‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’中進行農桿菌瞬時表達分析，結果表明‘隴薯12號’可以識別效應子E38產生特異的HR，預示‘隴薯12號’存在識別E38的潛在R基因（圖2）。而‘L05Nsr-j-1’則不能識別E38，未產生特異的HR。

圖1 ‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’的晚疫病抗性鑒定Figure 1 Late blight resistance identification of'Longshu 12'and'L05Nsr-j-1'

圖2 效應子E38在‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’葉片上的識別表現Figure2 Recognition performanceof Agrobacterium-mediated transformation of'Longshu 12'and'L05Nsr-j-1'with effector E38

2.3 dRenSeq檢測揭示‘隴薯12號’中存在未知晚疫病抗病基因

‘隴薯12號’除對“超級生理小種”CN152表現為感病外，對90128、T30-4及428-2 3個菌株均表現為抗病，‘L05Nsr-j-1’則對以上4個菌株均表現為感病。為確認‘隴薯12號’的抗性是否來源于已知的NB-LRR基因，采用了R基因診斷技術dRenSeq對‘隴薯12號’進行了富集分析，結果顯示，在容許1%和2%錯配率時，‘隴薯12號’的reads沒有完全覆蓋所檢測的任一基因（表4，圖3）。因此推測，‘隴薯12號’的抗性可能來源于這些基因外的其他基因或同源基因。

2.4 F1分離群體大部分基因型對農桿菌敏感

為了挖掘‘隴薯12號’中含有的特異識別效應子E38的潛在抗病基因，本研究將E38在‘隴薯12號’和‘L05Nsr-j-1’雜交的F1分離群體215個單株上進行農桿菌瞬時表達分析，理論上攜帶潛在抗病基因的個體會識別效應子E38進而出現細胞壞死的表型。結果顯示F1群體145個（67%）單株陰性對照出現細胞壞死，表現出假陽性反應；70個（33%）單株陽性對照和陰性對照均正常，其中23個單株能被E38識別產生HR，47個單株不能被E38識別產生HR（圖4）。

表4 ‘隴薯12號’NLR基因的覆蓋率Table 4 NLRcoveragein'Longshu 12'

圖3 d RenSeq分析‘隴薯12號’中的NLR基因Figure 3 d RenSeq analysis of NLR genes on'Longshu 12'

圖4 效應子E38在F1群體基因型進行農桿菌接種的實例Figure 4 Examples of agroinfiltration in F1 population genotypes with effector E38

3 討論

晚疫病是馬鈴薯的第一大病害，嚴重制約中國乃至世界馬鈴薯產業的發展。尋找優異抗源材料，挖掘和利用新的R基因，對于促進馬鈴薯抗晚疫病育種尤為重要。盡管國內外研究者進行了大量研究，在馬鈴薯中克隆了近30個晚疫病R基因[9]，但這些基因全部來自野生種，且很多抗性已經被克服，包括R pi-blb1/RB、Rpi-sto1和Rpi-pta1[23]等一些廣譜抗性基因抗性被快速進化的生理小種克服。馬鈴薯野生種中具有豐富的等位基因多態性，利用于遺傳育種，可以拓展育種材料的遺傳基礎[24]。然而，野生種與栽培種之間普遍具有雜交不親和、胚乳敗育、雄性不育等生殖障礙[25]，導致野生資源利用難度增大。馬鈴薯普通栽培種經過長期的適應性選擇，聚集了高產優質等優良的農藝性狀，其中不乏一些晚疫病抗性強的材料。如果能在普通栽培種中篩選到優良抗源材料、挖掘R基因，將顯著提高馬鈴薯抗晚疫病育種效率。

本研究所用材料普通栽培種品種‘隴薯12號’植株在田間高抗晚疫病[26]，室內接種鑒定對“超級生理小種”CN152外的其余3個菌株表現為高抗或免疫，通過系譜分析發現‘隴薯12號’含有‘小白花’、‘渭會4號’、‘中德6號’及‘大西洋’的血緣，其中‘小白花’為中國農家品種，在1983年出版的《全國馬鈴薯品種資源編目》中記載具有較強晚疫病抗性。近年來，逐漸發展起來的效應子組學策略大大提高了抗病資源的評價和篩選及R基因的鑒定和利用效率[27]。本研究中晚疫病菌效應子E38可以激發‘隴薯12號’產生特異的HR反應，dRenSeq檢測其未包含已知的R基因。然而通過農桿菌介導的瞬時表達在F1群體進行E38的識別，67%的材料出現假陽性反應，表明群體不適合采用農桿菌介導的瞬時表達進行效應子識別挖掘抗病基因，這與Chen等[13]結果相符，在其研究中野生種S.verrucosum群體不適合用農桿菌或PVX介導的瞬時表達進行高通量的效應子組學篩選和鑒定。

本研究通過晚疫病抗性鑒定、效應子E38識別及dRenSeq等方法鑒定獲得‘隴薯12號’為含有未知R基因的優良抗源材料，對F1群體采用效應子E38識別挖掘抗病基因，但大部分材料出現背景反應，證實并非所有材料均適合效應子組學策略識別鑒定。本研究鑒定得到的‘隴薯12號’能夠識別效應子E38激發過敏反應，預示‘隴薯12號’存在潛在抗病基因，為以后克隆其抗病基因、抗病育種實踐和開展馬鈴薯與晚疫病菌分子互作奠定了基礎。