苗藥熏蒸驗方對體外培養骨性關節炎家兔軟骨組織的治療作用及機制研究①

張 琪 王 琳 李田洋 鄭曙光 貴州中醫藥大學貴陽550025

骨性關節炎(osteoarthritis,OA)是由多種因素引起的高發病率關節疾病,主要是骨、軟骨及滑膜等代謝變化導致關節軟骨結構炎癥和破壞,甚至累及關節周圍組織的全方位慢性退行性病變,其典型癥狀為關節腫痛、畸形、活動時出現磨擦聲等,以膝關節受累最為常見,高發于女性及中老年患者[1-3]。OA發病機制復雜、起病隱匿、病程長、易復發、難痊愈,導致其致殘率居高不下,損傷患者身心健康,降低患者生存質量。目前OA的病因及機制尚未明確,故尚無理想治療方案。課題組在臨床治療及前期實驗研究中發現,苗熏驗方對關節軟骨損傷性關節炎具有一定治療作用,抗炎鎮痛效果良好[4-6]。而在體外培養軟骨組織的藥效學研究尚未見報道,因此,本研究以碘乙酸鈉誘導OA家兔模型,分離培養目標軟骨組織塊,苗熏驗方水溶液培養,研究苗熏驗方有效成分對家兔退行性關節軟骨炎癥因子、二型膠原蛋白(COL-Ⅱ)和基質金屬蛋白酶的影響,探討其防治關節軟骨退變的可能機制,進一步驗證苗熏驗方緩解OA炎癥疼痛的機制,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年新西蘭大白兔36只,體重(2.0±0.2)kg,購自重慶騰鑫養殖公司,許可證號:SCXK(渝)2017-001。清潔級動物房飼養,室溫下復合飼料喂養。

1.1.2 主要試劑與儀器 苗醫熏蒸液組方由大血藤、小血藤、雞血藤、透骨香、飛龍掌血、骨碎補、淫羊藿等12味藥材組成,均購自貴州同濟堂(按配方比例稱取,以8倍水浸泡2 h,蒸餾冷凝提取藥物有效成分50 ml,相當于生藥藥液3.6 g/ml,0.22μm微孔濾膜過濾,-20℃保存備用)；D-(+)-Glucosamine HCl(批號:G8240)購自北京索萊寶生物科技有限公司；Rabbit IL-1βELISA Kit(批號:JYM0011Rb)、Rabbit TNF-αELISA Kit(批號:JYM0003Rb)購自武漢基因美生物科技有限公司；Rabbit Anti-COL-Ⅱ(批號:bs-6319R)購自Bioss生物有限公司；酶標儀(型號:1510)購自賽默飛世爾有限公司；水平電泳儀(型號:JY300)購自君意東方電泳設備有限公司；PCR儀(型號:EDC-810)購自東勝創新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥 新西蘭大白兔隨機分為2組,正常組6只,模型組30只。以7.5 mg/kg劑量向雙膝關節腔推注碘乙酸鈉溶液復制膝骨OA模型[7]。造模成功后,取軟骨組織,切取表層尺寸為3 mm×3 mm×1 mm的軟骨組織塊作為實驗對象,分為模型組、陽性對照組、苗熏低、中、高劑量組,與正常組共同培養2 d和4 d,陽性對照組于完全培養液中稀釋鹽酸氨基葡萄糖為10 mmol/L,苗熏低、中、高劑量組于完全培養液中培養,稀釋原冷凝蒸餾提取的苗熏藥物原液培養,分別為360、720、1 440 mg/ml,于37℃、5%CO2培養箱內分別培養2 d和4 d。培養完成后采集軟骨組織培養樣品和培養上清液于-80℃待測。

1.2.2 ELISA檢測軟骨組織體外培養上清液IL-1β、TNF-α水平 Trizol法提取軟骨組織培養液,3 000 r/min離心20 min,取上清,ELISA測定IL-1β、TNF-α水平,按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA在軟骨組織中的表達 提取軟骨組織總RNA。當OD260/OD280值為1.8～2.0時,根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為RNA,根據RT-PCR擴增試劑盒說明檢測mRNA水平,2-ΔΔCt法計算。引物序列見表1。

1.2.4 Western blot檢測軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達 在剪碎的組織塊中加入RAPI裂解液裂解,充分勻漿,冰上裂解,離心收集上清,BCA定量法測定蛋白濃度,沸水中變性,取40μg上樣,凝膠電泳,轉膜,封閉,浸泡于COL-Ⅱ抗體(1∶2 000)孵育液中4℃孵育過夜,加入二抗(1∶50 000)室溫孵育,ECL顯色。

1.3 統計學處理 采用SPSS24.0軟件進行數據分析,正態分布的計量數據以表示,統計分析前進行正態性及方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 家兔軟骨組織培養上清IL-1β、TNF-α水平相同培養時間,與正常組相比,模型組IL-1β、TNF-α水平明顯上調(P＜0.05),與模型組相比,苗熏驗方低、中、高劑量組及陽性對照組IL-1β、TNF-α水平明顯下調(P＜0.05),相同組不同培養時間差異無統計學意義(P＞0.05,表2)。提示苗藥熏蒸驗方可降低OA軟骨組織炎癥因子IL-1β、TNF-α水平,抑制軟骨基質降解,修復軟骨組織。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 培養上清中IL-1β、TNF-α表達(，ng/L)Tab.2 Expressions of IL-1βand TNF-αin culture supernatant(，ng/L)

表2 培養上清中IL-1β、TNF-α表達(，ng/L)Tab.2 Expressions of IL-1βand TNF-αin culture supernatant(，ng/L)

Note:Compared with Normal group,1)P＜0.05；compared with Model group,2)P＜0.05.

Groups IL-1β TNF-α 2 d 4 d Normal 17.10±0.63 16.96±0.67 6.31±0.59 6.98 2 d 4 d±0.19 Model 28.57±1.561) 26.29±0.751) 13.47±0.501) 13.13±1.181)Positive 23.99±0.732) 22.71±0.652) 10.99±0.802) 10.57±0.542)Low-dose 24.23±0.522) 23.31±0.242) 11.73±0.272) 11.46±0.572)Mid-dose 20.81±0.442) 20.83±0.682) 10.45±0.442) 9.99±0.372)High-dose 19.19±0.642) 17.74±1.132) 9.15±0.402) 8.53±1.42)

圖1 軟骨組織MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達Fig.1 Expressions of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 mRNA in cartilage

圖2 軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達Fig.2 Expression of COL-Ⅱprotein in cartilage

2.2 家兔軟骨組織MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達 相同培養時間中,與正常組相比,模型組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,苗熏驗方低、中、高劑量組及陽性對照組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達顯著降低(P＜0.05),相同組不同培養時間差異無統計學意義(P＞0.05,圖1)。提示苗藥熏蒸驗方可能通過調節MMPs mRNA表達改善關節軟骨病理狀態。

2.3 家兔軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達 相同培養時間中,與正常組相比,模型組COL-Ⅱ蛋白表達明顯降低(P＜0.05),與模型組相比,苗熏驗方低、中、高劑量組及陽性對照組COL-Ⅱ蛋白表達明顯上升(P＜0.05),相同組不同培養時間差異無統計學意義(P＞0.05,圖2)。提示苗藥熏蒸驗方可能通過上調凋亡相關蛋白表達發揮抗炎鎮痛作用。

3 討論

OA作為臨床常見慢性炎癥性疾病,以關節腔內慢性炎癥和軟骨組織損傷為主要病理特征。研究顯示,SDF-1/CXCR4結合參與多種炎癥性疾病及炎癥調節,信號傳導途徑誘導蛋白水解酶釋放,上調炎癥細胞因子表達,導致軟骨分解合成代謝失衡,細胞外基質破壞,炎癥反應發生[8-9]。苗藥熏蒸驗方為按照苗醫理論方劑收集的民間驗方,在黔南、黔東南地區長期應用于OA、股骨頭壞死等骨科疾病,方法獨特,簡便易行,療效確切,毒副作用較小,含有藤本類植物,苗醫理論認為此類植物長而薄的分布與人體肌肉和筋脈相似,且具有通氣除風散血和舒筋通脈活絡作用[10]；透骨香有祛風除濕、理氣散寒止痛、活血通絡之功效；淫羊藿、骨碎補溫陽散寒,壯骨通痹,合用既能排毒、抗炎鎮痛,還可通筋脈,補氣、血,臨床常用于治療OA、股骨頭壞死、皮膚病等疾病,療效顯著[11]。前期研究發現,苗熏療法可有效抑制OA兔軟骨中炎癥因子蛋白表達,同時抑制OA軟骨細胞凋亡,延緩OA病理進程,改善軟骨病變。提示苗藥熏蒸療法對OA家兔具有一定治療作用,但具體作用機制尚未明確[12]。苗熏驗方曾作為臨床經驗方劑通過外用熏蒸療法直接用于臨床治療,將藥療及熱療相結合,針對早期股骨頭壞死臨床治療效果顯著,且優于常規藥物治療對照組,療效確切、用藥安全,可明顯緩解關節腫痛,改善功能障礙等臨床癥狀和體征,提高患者生存質量,并具有簡、便、廉、驗等特點[6]。課題組前期已進行了較為系統的苗醫理論和驗方的調查整理工作,并進行了動物實驗和臨床研究,苗醫熏蒸療法不僅可改善實驗動物局部血液循環、降脂、改善骨組織結構,而還可改善臨床癥狀,縮短病程。

本研究采用關節腔注射碘乙酸鈉法復制OA家兔模型,檢測不同劑量苗藥熏蒸驗方水溶液對體外培養OA家兔關節軟骨組織炎癥因子水平的影響,結果表明苗熏驗方有效成分可顯著降低以活化單核巨噬細胞為主的促炎因子IL-1β和TNF-α水平。TNF-α與IL-1β存在協同作用,TNF-α不僅可破壞軟骨細胞,還可促進IL-1β分泌,放大炎癥反應,加重軟骨組織損傷。研究顯示,人或動物OA模型中IL-1β、TNF-α水平均明顯提高[13-14]。因此,本研究結果表明苗藥熏蒸驗方可通過減少IL-1β、TNF-α分泌抑制OA家兔軟骨組織損傷。

關節軟骨主要由軟骨細胞及周圍細胞外基質構成,細胞外基質主要由膠原蛋白和蛋白多糖組成。其中COL-Ⅱ占膠原蛋白90%以上,是關節軟骨的主要膠原成分,維持軟骨表型結構和細胞功能,為軟骨細胞外基質提供支架及彈性。當軟骨退化速度遠快于合成速度時,意味著軟骨細胞分泌大量水解酶,基質金屬蛋白酶(MMP)是軟骨細胞外基質中最重要的蛋白水解酶之一,是一類鋅離子依賴性肽鏈內切酶,直接參與軟骨細胞轉移、代謝和凋亡,促進基質蛋白和膠原降解,導致關節軟骨纖維結構受損,引起關節軟骨抗外力作用降低,從而導致軟骨損傷,同時受IL-1β等炎癥因子影響,介導軟骨損傷。其中MMP-3具有強大的基質分解作用,可降解多型膠原,參與結締組織重構；MMP-9多由炎癥細胞分泌,具有促凋亡作用,參與細胞外基質合成和降解過程；MMP-13通過抑制成骨細胞分泌COL-Ⅱ發揮膠原降解作用。研究顯示,MMP-3、MMP-9基因敲除小鼠OA得到明顯改善[15-16],且體外通過TNF-α誘導軟骨細胞并敲除MMP-3、MMP-13可明顯抑制膠原蛋白和聚集蛋白聚糖降解。本研究進一步探討苗藥熏蒸驗方對OA大鼠軟骨組織中細胞外基質合成與降解蛋白表達的影響,表明苗藥熏蒸驗方可明顯上調COL-Ⅱ蛋白表達,下調MMP-3、MMP-9、MMP-13基因表達,維持軟骨基本結構。對比2 d和4 d的研究結果,藥物干預組無明顯差異,說明苗熏驗方水溶液在軟骨組織的治療中具有穩定性,具有較高臨床價值。

綜上所述,苗藥熏蒸驗方可通過促進軟骨細胞外基質合成,抑制細胞外基質降解,減少炎癥因子分泌,進而抑制OA家兔軟骨組織損傷,療效確切,但遠期療效有待進一步研究。