lncRNA BRE-AS1調控Wnt/β-catenin信號通路影響宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡的實驗研究

張 若 張 鳶 海南醫學院第二附屬醫院東湖分院婦產科海口570100

宮頸癌是女性癌癥死亡的重要因素之一,已明確其病因與高危型人乳頭瘤病毒持續感染有關；近年來宮頸癌發病率和發病年齡有明顯升高和年輕化的趨勢,嚴重威脅著廣大女性的身體健康[1-2]。隨著臨床治療的不斷發展,腫瘤精準靶向治療有可能成為治愈宮頸癌的關鍵性策略,而尋找有效的作用靶點已成為學者們的研究熱點[3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,不具有編碼蛋白質的功能。研究顯示,宮頸癌組織中存在多種lncRNAs的異常表達,而這些表達異常的lncRNAs可通過影響腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡等生物過程參與宮頸癌的發生發展,有望成為宮頸癌精準靶向治療的重要靶標[4-6]。BRE基因的反義RNA(BRE antisense RNA,AS1)是一種新發現的lncRNA,定位于人2p23.2染色體上,長1 667 bp；被證實在腎細胞癌和前列腺癌組織中表達下調,且可通過調控細胞增殖、凋亡等發揮抑癌作用[7-8]。近年來有研究發現,lncRNA BRE-AS1在宮頸癌組織中異常低表達,但其在宮頸癌發生發展中的作用并不清楚[9]。因此,本研究開展體外細胞實驗,通過觀察lncRNA BRE-AS1在宮頸癌SiHa細胞中的表達情況以及其對SiHa細胞增殖、侵襲和凋亡的影響,以揭示lncRNA BRE-AS1在宮頸癌發生發展中的作用,為宮頸癌的靶向治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮頸上皮永生化細胞系H8和宮頸癌細胞系SiHa(中國醫學科學院基礎醫學研究所)。低糖改良eagle培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)和胎牛血清(美國Hyclone公司),青霉素、鏈霉素和脂質體2000(美國Invitrogen公司),0.25%胰蛋白酶和Trizol試劑(武漢博士德公司),二甲基亞砜(美國Life Technologies公司),噻唑藍試劑(美國Fisher Scientific公司),逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒(華美生物工程公司),蛋白提取試劑盒(美國Activemotif公司),cDNA反轉錄試劑盒(美國應用生物系統公司),考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究),辣根過氧物化酶-抗山羊IgG二抗(北京中杉生物技術公司)。lncRNA BRE-AS1表達載體和空載體(上海Sangon公司構建完成)。Transwell小室(美國BD FalconTM公司),凝膠成像系統(美國IMAGE公司),CO2恒溫細胞培養箱(美國Sheldon公司),熒光顯微鏡(日本OLYMNPUS公司),紫外分光光度計(日本HITACHI公司),PCR儀(美國ABI公司),流式細胞儀(德國Beckman Coulter公司),酶聯免疫檢測儀(奧地利Anthos公司)。鼠抗人β-連環素(βcatenin)單克隆抗體(美國Abcam公司),兔抗人細胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白多克隆抗體、鼠抗人c-Myc單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體和鼠抗人基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP-2)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 采用含100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養基在5%CO237℃恒溫培養箱內常規培養SiHa細胞和H8細胞。每隔1 d更換培養液,待細胞貼壁后加入0.25%胰蛋白酶消化,并按照1∶3比例傳代。

1.2.2 熒光定量PCR檢測lncRNA BRE-AS1的表達 采用Trizol法提取SiHa細胞和H8細胞的總RNA后,使用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度與純度。以RNA為模板,參照cDNA反轉錄試劑盒說明書步驟進行反轉錄。再以反轉錄產物cDNA為模板,參照RT-PCR試劑盒說明書根據上海生工生物合成的PCR引物(lncRNA BRE-AS1上游:5′-GTTGATTGTCGGCATTACTG-3′,下游:5′-CATCGTTTTCAGAGGTTGTA-3′；β-actin上游5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′,下 游:5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′)上PCR儀進行擴增。采用2-ΔCt法檢測SiHa細胞和H8細胞中lncRNA BRE-AS1的表達水平。

1.2.3 實驗分組與細胞轉染 取6孔細胞板,并按照每孔105個細胞密度將對數生長期的SiHa細胞進行接種。接種完畢后,置于恒溫培養箱內常規培養。實驗分為未轉染組(正常培養)、陰性對照組(轉染空載體)和lncRNA BRE-AS1組(轉染lncRNA BRE-AS1表達載體),每組設置3個平行孔。待細胞培養至70%～80%匯合度時,根據實驗分組參照脂質體2000說明書將lncRNA BRE-AS1表達載體和空載體轉染至SiHa細胞中。轉染5 h后以新鮮培養液替換原培養液后繼續培養,48 h后以胰蛋白酶消化收集各組細胞,采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中lncRNA BRE-AS1的表達水平以評價轉染效果。

1.2.4 噻唑藍法檢測細胞增殖 將對數生長期的lncRNA BRE-AS1組、陰性對照組和未轉染組細胞以3×104個/孔接種至96孔細胞板上后,置于恒溫箱內常規培養12 h、24 h、48 h和72 h后,棄培養液,加入5 g/L噻唑藍試劑20μl/孔孵育4 h。再加入二甲基亞砜150μl/孔振蕩反應10 min。采用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處檢測各組細胞的光密度值。實驗重復3次。

1.2.5 平板克隆實驗檢測細胞克隆增殖能力 胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的lncRNA BRE-AS1組、陰性對照組和未轉染組細胞后,調整細胞密度為1×105個/ml。將細胞懸液按照100μl/孔接種至6孔細胞板上后,置于恒溫細胞培養箱內常規培養12～14 d。有集落生成時,終止培養。使用磷酸緩沖液洗滌細胞2次后,分別以10%甲醇、0.5%結晶紫對細胞進行固定與染色,作用時間均為20 min。采用顯微鏡在低倍鏡下觀察拍照并計數。其中,將超過10個細胞的集落作為一個有效克隆,以克隆數與接種細胞數的百分比表示各組細胞的克隆形成率。實驗重復3次。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲 采用無血清培養液按照1∶5比例對基質膠稀釋后,加入Transwell小室濾膜上,使之均勻分布,室溫下干燥至充分融合。以胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的lncRNA BRE-AS1組、陰性對照組和未轉染組細胞,并使用無血清培養液調整細胞濃度為5×104個/ml。將細胞懸液以200μl/孔接種至小室上層,并在小室下層每孔中加入600μl含血清培養液。置于恒溫細胞培養箱內孵育24 h后,取出小室。以棉簽小心拭去濾膜上殘留的細胞后,使用甲醛和結晶紫分別對膜下細胞進行固定與染色,使用顯微鏡并在高倍鏡下觀察各組中的穿膜細胞數。實驗重復3次。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的lncRNA BRE-AS1組、陰性對照組和未轉染組細胞,經1 000 r/min離心5 min后,采用磷酸緩沖液洗滌2次。加入500μl結合緩沖液調整細胞濃度為1×105個/ml,向100μl的細胞懸液中加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、碘化丙啶各5μl,置于避光條件下反應15 min。在60 min內上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.2.8 Western blot檢測細胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達 參照總蛋白提取試劑盒說明書提取轉染48 h后的lncRNA BRE-AS1組、陰性對照組和未轉染組細胞總蛋白,并根據考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書對總蛋白的濃度進行定量。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液(4∶1)混勻后,置于100℃水浴鍋中煮沸5 min。將熱變性后的蛋白樣品按照60μg/孔加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。電泳停止后,采用半干法轉至聚偏二氟乙烯膜。以5%脫脂奶粉封膜2 h后,將膜浸入到一抗工作液(β-catenin 1∶1 000、c-Myc 1∶500、Cyclin D1 1∶500、MMP-2 1∶800和β-actin 1∶1 000抗體)中搖床上4℃孵育過夜。次日,以二抗工作液(1∶5 000)搖床上室溫孵育1 h后,以發光劑顯色,凝膠成像系統掃描,Image J軟件分析各組細胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達水平,其中以β-actin作為內參對目的蛋白的表達水平進行校正。實驗重復3次。

1.3 統計學分析 實驗數據以形式表示,采用SPSS22.0進行統計學分析,多組間比較使用單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA BRE-AS1在宮頸癌SiHa細胞中的表達及轉染效果 熒光定量PCR檢測結果顯示,宮頸癌SiHa細胞中lncRNA BRE-AS1的表達水平為0.25±0.03,與人子宮頸上皮永生化細胞H8中lncRNA BRE-AS1的表達水平1.00±0.07相比,明顯降低(t=29.54,P=0.00＜0.01)；在宮頸癌SiHa細胞轉染lncRNA BRE-AS1表達載體后發現lncRNA BRE-AS1的表達水平較未轉染組明顯升高(P＜0.05)；但轉染空載體(陰性對照組)的SiHa細胞中lncRNA BRE-AS1的表達水平與未轉染組相比未見明顯改變(P＞0.05)。見表1。

2.2 lncRNA BRE-AS1對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響 噻唑藍法檢測結果顯示,與未轉染組相比,轉染lncRNA BRE-AS1表達載體24 h、48 h、72 h后lncRNA BRE-AS1組細胞的增殖活力明顯降低(P＜0.05),但轉染空載體的陰性對照組細胞增殖活力與未轉染組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.3 lncRNA BRE-AS1對宮頸癌細胞克隆形成能力的影響 平板克隆實驗檢測未轉染組、陰性對照組和lncRNA BRE-AS1組細胞的克隆形成率分別為(41.05±3.36)%、(38.85±2.64)%和(23.52±2.15)%,三組細胞的克隆形成率相比較,差異具有統計學意義(F=107.60,P=0.00＜0.05),且lncRNA BREAS1組的克隆形成率明顯低于未轉染組(P＜0.05),但陰性對照組和未轉染組之間的克隆形成率差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

表1 各組SiHa細胞中lncRNA BRE-AS1的表達水平Tab.1 Expression level of lncRNA BRE-AS1 in SiHa cells of each group

2.4 lncRNA BRE-AS1對宮頸癌細胞侵襲能力的影響 Transwell小室檢測結果顯示,與未轉染組相比,陰性對照組中穿膜細胞數無明顯變化(P＞0.05),但lncRNA BRE-AS1組中穿膜細胞數較未轉染組明顯減少(P＜0.05)。見圖2和表3。

2.5 lncRNA BRE-AS1對宮頸癌細胞凋亡能力的影響 流式細胞儀檢測結果顯示,lncRNA BREAS1組細胞凋亡率較未轉染組明顯升高(P＜0.05),而陰性對照組和未轉染組之間的細胞凋亡率差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3和表3。

2.6 lncRNA BRE-AS1對宮頸癌細胞Wnt/βcatenin信號通路的影響 免疫印跡法檢測結果顯示,與未轉染組相比,lncRNA BRE-AS1組細胞中Wnt/β-catenin信號通路關鍵調控因子β-catenin及其下游相關蛋白c-Myc、Cyclin D1和MMP-2的表達水平均明顯降低(P＜0.05)；但陰性對照組細胞中這四項指標的表達水平未見明顯變化(P＞0.05)。見圖4和表4。

圖1 平板克隆實驗檢測結果Fig.1 Results of plate cloning experiment test

圖2 Transwell小室檢測各組細胞侵襲結果Fig.2 Results ofcell invasion in each group were detected by Transwell chamber

表2 轉染不同時間后各組SiHa細胞光密度值的比較Tab.2 Comparison of optical density values of SiHa cells in each group after different time of transfection

表2 轉染不同時間后各組SiHa細胞光密度值的比較Tab.2 Comparison of optical density values of SiHa cells in each group after different time of transfection

Note:Compared with the control group,1)P＜0.05.

Groups 12 h 24 h 48 h 72 h Untransfected 0.16±0.02 0.27±0.03 0.45±0.03 0.97±0.06 Negative control 0.19±0.03 0.28±0.03 0.48±0.04 1.12±0.09 lncRNA BRE-AS1 0.18±0.03 0.15±0.021) 0.26±0.031) 0.62±0.041)F 2.86 64.23 113.03 133.65 P 0.08 0.00 0.00 0.00

表3 各組中穿膜細胞數和細胞凋亡率的比較Tab.3 Comparison of number of transmembrane cells and apoptosis rate in each group

表3 各組中穿膜細胞數和細胞凋亡率的比較Tab.3 Comparison of number of transmembrane cells and apoptosis rate in each group

Note:compared with the control group,1)P＜0.05.

Groups Number of transmembrane cells Apoptosis rate(%)Untransfected 92.85±5.32 6.76±1.03 Negative control 88.76±6.28 8.15±1.26 lncRNA BRE-AS1 43.32±3.251) 21.34±3.121)F 260.61 141.18 P 0.00 0.00

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結果Fig.3 Results of apoptosis in each group were detected by flow cytometry

圖4 Western blot檢測β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達Fig.4 Expression ofβ-catenin，c-Myc，Cyclin D1 and MMP-2 were detected by Western blot

表4 各組細胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達水平Tab.4 Expression levels ofβ-catenin，c-Myc，cyclin D1 and MMP-2 in cells of each group

表4 各組細胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達水平Tab.4 Expression levels ofβ-catenin，c-Myc，cyclin D1 and MMP-2 in cells of each group

Note:Compared with the control group,1)P＜0.05.

Groups β-catenin c-Myc Cyclin D1 MMP-2 Untransfected 0.76±0.07 0.91±0.06 1.23±0.12 0.89±0.06 Negative control 0.78±0.05 0.88±0.06 1.18±0.15 0.86±0.05 lncRNA BRE-AS1 0.39±0.031) 0.26±0.031) 0.43±0.041) 0.51±0.031)F 156.90 448.78 140.84 172.16 P 0.00 0.00 0.00 0.00

3 討論

宮頸癌的發病因素除了與人乳頭瘤病毒的外部感染有關外,還與多種基因的異常表達密切相關；而這些異常表達的基因如lncRNA SRA1、lncRNA CASC11和lncRNA SBF2-AS1等往往可通過調控腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學行為在宮頸癌的發生發展過程中發揮致癌或抑癌的作用[10-12]。因此不斷發現和了解新的lncRNA的作用對宮頸癌機制研究和治療具有重要意義。

lncRNA BRE-AS1是一種腫瘤相關的非編碼RNA。張艷秋[13]研究指出,在91例肺癌組織中檢測到lncRNA BRE-AS1表達下調,且其表達水平的改變與肺癌發病風險呈負相關；而體外細胞實驗證實lncRNA BRE-AS1可通過抑制細胞增殖和誘導細胞周期阻滯和凋亡參與肺癌的發生發展。WANG等[14]研究發現,322例肌肉浸潤性膀胱癌組織中lncRNA BRE-AS1異常低表達,且lncRNA BRE-AS1的表達與肌肉浸潤性膀胱癌的發生和/或進展相關。陳干濤等[9]在20例宮頸癌組織中發現lncRNA BRE-AS1表達下調,但lncRNA BRE-AS1在宮頸癌中的作用如何并不清楚。本研究首先檢測到lncRNA BRE-AS1在宮頸癌SiHa細胞中的表達水平明顯低于人子宮頸上皮永生化細胞H8；通過轉染lncRNA BRE-AS1表達載體成功上調SiHa細胞中lncRNA BRE-AS1的表達后發現,SiHa細胞增殖和侵襲能力明顯受到抑制,且細胞凋亡能力明顯增強。這提示宮頸癌中lncRNA BRE-AS1通過調控細胞增殖、侵襲和凋亡發揮著重要的抑癌作用。

Wnt/β-catenin信號通路是細胞內重要的信號轉導途徑,β-catenin是該途徑的重要調控因子,其過度積累可進入細胞核,激活下游相關靶基因如原癌基因c-Myc、周期蛋白Cyclin D1和轉移相關蛋白MMP-2的表達,進而促進腫瘤細胞的惡性增殖和轉移[15-17]。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與宮頸癌的發生和發展密切相關[18-20]。本研究進一步檢測發現,上調lncRNA BRE-AS1表達還可引起宮頸癌SiHa細胞中β-catenin、c-Myc、Cyclin D1和MMP-2蛋白的表達降低。CHEN等[8]在前列腺癌中發現,低表達的lncRNA BRE-AS1與miR-145的表達水平呈正相關；體外細胞實驗證實lncRNA BRE-AS1高表達可介導前列腺癌細胞中miR-145表達上調,且可抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡。王香青等[21]證實,miR-145低表達與宮頸癌患者預后不良密切相關,且可通過與Cateninδ-1作用直接抑制Wnt/β-catenin信號通路而發揮抑癌作用。結果提示,lncRNA BRE-AS1可能通過調控miR-145表達間接抑制Wnt/β-catenin信號通路活化,進而影響細胞增殖、侵襲和凋亡來發揮抑制宮頸癌的作用。

綜上所述,lncRNA BRE-AS1可抑制宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲并促進其凋亡,其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。該結果初步揭示了lncRNA BRE-AS1在宮頸癌發生發展中的作用,為后期lncRNA BRE-AS1在宮頸癌中的研究奠定了基礎。