基于UPLC-Q-TOF/MS的復方魚腥草合劑大鼠血清藥物化學研究

金漢臺，劉建庭，王建方，張洪兵，劉芯亦，何厚洪，許 浚*，張鐵軍*

1.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400

2.天津藥物研究院 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300462

3.天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300193

4.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052

5.浙江省中藥制藥技術重點實驗室，浙江 杭州 310052

6.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

復方魚腥草合劑由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹和金銀花5味中藥組成，具有清熱解毒之功效，臨床上常用于外感風熱引起的咽喉腫痛、急性咽炎、扁桃腺炎有風熱證候者[1]。由于復方魚腥草合劑為臨床療效確切的中藥復方制劑，其化學成分組成復雜，藥效物質基礎尚不清楚，嚴重制約了其臨床推廣應用。

中藥血清藥物化學依據(jù)中藥經(jīng)口給藥的特點，通過分析口服給藥后能進入血液的化學成分及其代謝產(chǎn)物，從入血成分的角度，研究中藥的藥效物質基礎[2-3]。同時，超高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術（UPLC-Q-TOF/MS）具有快速、靈敏、高效的特點，也為中藥吸收入血成分的快速發(fā)現(xiàn)和辨識提供了技術方法。近年來，質量標志物（quality marker，Q-Marker）作為中藥質量的核心，是與藥效密切相關的標志性活性化學成分，更重要的是，Q-Marker貫穿質量傳遞體系，是質量過程控制的基礎[4-5]。因此，對于Q-Marker的發(fā)現(xiàn)，研究從藥材到復方制劑再到血液的化學轉移過程非常重要。

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術，在口服給予復方魚腥草合劑的大鼠血漿中共鑒定出24個化學成分，其中包括15個原型成分和9個代謝產(chǎn)物，為其藥效物質基礎和Q-Marker的確定奠定了基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Xevo G2 Q-TOF高分辨質譜（美國Waters公司）；AB204-N電子天平（德國Meteler公司）；BT25S電子天平（德國 Sartorius 公司）；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技公司）；VORTEX-5旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造公司）；TG20-WS臺式高速離心機（長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）。

1.2 材料

咖啡酸（批號110885-200102）、黃芩苷（批號110715-201821）、漢黃芩苷（批號112002-201702）、黃芩素（批號111595-201808）、漢黃芩素（批號111514-201605）購自中國食品藥品檢定研究院，連翹苷（批號PS006-0025MG）購自成都普思生物科技股份有限公司，對照品質量分數(shù)均大于95%；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純），購自天津康科德科技有限公司；純凈水購自杭州娃哈哈飲用水有限公司；復方魚腥草合劑來自浙江康恩貝中藥有限公司。

雄性SD大鼠，SPF級，體質量170～190 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。置于室溫25 ℃、濕度50%，12 h晝夜交替，自由采食、飲水飼養(yǎng)適應1周。實驗前禁食（不禁水）12 h。動物實驗經(jīng)天津天誠新藥評價有限公司批準，倫理批準號2019110103。

2 方法

2.1 動物實驗

取10支（10 mL/支）復方魚腥草合劑，采用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至20 mL，作為復方魚腥草合劑大鼠ig溶液。

雄性SD大鼠，隨機分為2組并稱定體質量，對照組按10 mL/kg ig給予純凈水，魚腥草合劑給藥組按10 mL/kg的劑量ig給予復方魚腥草合劑大鼠ig溶液。給藥1 h后以1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血置肝素化試管中，于4 ℃條件下3500 r/min離心10 min分離血漿，置?20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 溶液及血漿樣品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、咖啡酸、連翹苷對照品適量，加甲醇配制成質量濃度為1 mg/mL的混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，供UPLC-Q-TOF/MS檢測分析。

2.2.2 供試品溶液的制備 取復方魚腥草合劑適量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過至進樣小瓶中，作為復方魚腥草合劑體外供試品溶液，供UPLC-QTOF/MS檢測分析。

2.2.3 血漿樣品的制備 取大鼠給藥血漿樣品500μL置于EP管中，加入2 mL甲醇，渦旋1 min混勻，于4 ℃條件下9000×g離心10 min沉淀蛋白，上清液4 ℃下N2吹干，殘渣以200 μL甲醇渦旋1 min復溶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液供UPLC-Q/TOF-MS檢測分析。空白血漿進行同樣操作。

2.3 UPLC-MS分析條件

2.3.1 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～2 min，95% A；2～9 min，95%～80% A；9～20 min，80%～70% A；20～24 min，70%～62% A；24～27 min，62% A；27～30 min，62%～35% A；30～31 min，35%～5%A；31～33 min，5% A；柱溫35 ℃；體積流量0.2 mL/min；進樣量5 μL。

2.3.2 質譜條件 Xevo G2 Q-TOF高分辨質譜儀，配備電噴霧離子源（ESI），負離子模式下進行監(jiān)測，負離子模式毛細管電壓2 kV。離子源溫度110 ℃，樣品錐孔電壓30 V，錐孔氣體積流量50 L/h，氮氣脫氣溫度350 ℃，脫氣體積流量800 L/h，掃描范圍m/z50～2000，內參校準液亮氨酸腦啡肽用于相對分子質量實時校正。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用MasslynxTM4.1軟件進行數(shù)據(jù)處理，分析色譜圖信息以及各色譜峰的質譜信息，對給藥組和對照組大鼠血漿樣品進行原型成分和代謝物的檢測和分析。

3 結果

采用“2.3”項下所述優(yōu)化的UPLC-Q-TOF/MS條件，對復方魚腥草合劑、大鼠空白血漿及給藥血漿樣品進行檢測分析，在負離子模式下，復方魚腥草合劑、大鼠空白血漿和給藥血漿樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1 負離子模式色譜圖Fig.1 Negative ion mode chromatogram

通過比對分析復方魚腥草合劑制劑和給藥血漿樣品的色譜圖，同時存在于復方魚腥草合劑與給藥血漿樣品中的離子被認為是潛在的以原型形式吸收的藥物成分。通過查閱Massbank、Chemspider等公共數(shù)據(jù)庫，并結合復方魚腥草合劑所含化學成分的相關文獻報道[6]，分析質譜裂解規(guī)律，在給予復方魚腥草合劑的大鼠血漿中共鑒定得到24個移行成分，包括15個吸收原型成分和9個代謝產(chǎn)物，其UPLC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)見表1、2。TOF/MS的實測值與理論值比較，精確質量數(shù)的誤差均小于1×10?5。代謝產(chǎn)物的主要代謝途徑見圖2、3。

表1 魚腥草合劑吸收入血原型成分LC-MS數(shù)據(jù)Table 1 LC-MS data of plasma prototype components of Yuxingcao Mixture

3.1 原型成分的鑒定

表2 復方魚腥草合劑血漿代謝成分LC-MS數(shù)據(jù)Table 2 LC-MS data of plasma metabolic components of Yuxingcao Mixture

在給予復方魚腥草合劑的大鼠血漿中鑒定出15個原型成分，包括9個黃酮醇及黃酮苷類成分，3個環(huán)烯醚萜類、2個有機酸類和1個木脂素類成分。

P2的準分子離子為 [M－H]?m/z179.035 7，確定分子式為C9H8O4，發(fā)生中性丟失形成碎片離子[M－CO2－H]?m/z135，通過與對照品比對，鑒定P2為咖啡酸。

P4的準分子離子為 [M＋HCOOH－H]?m/z403.124 3，確定分子式為C16H22O9，碎片離子m/z357 為 [M－H]?，m/z195為 [M－C6H10O5－H]?，結構中可能存在1分子六碳糖，通過查閱Massbank等數(shù)據(jù)庫，推測P4為獐牙菜苷。

P5的準分子離子為 [M－H]?m/z403.124 6，確定分子式為C17H24O11，碎片離子m/z371為 [MCH3OH－H]?，m/z223為 [M－C6H10O5－H2OH]?，通過查閱Massbank等數(shù)據(jù)庫，推測P5為斷氧化馬錢子苷。

圖2 咖啡酸可能的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of caffic acid

圖3 漢黃芩苷和黃芩苷可能的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of wogonin and baicalin

P11的準分子離子為 [M－H]?m/z459.092 7，確定分子式為C22H20O11，脫去葡萄糖醛酸形成碎片離子[M－GluA－H]?m/z283.06，再脫去CH2形成[M－GluA－CH3－H]?m/z268.03，再脫去CO和CO2分別形成碎片離子m/z239和m/z224，通過與對照品比對并結合文獻報道[7-9]，P11被鑒定為漢黃芩苷。通過相似的分析手段，與對照品比對，P8、P9、P14和P15被鑒定為黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷和漢黃芩素。

3.2 代謝產(chǎn)物的鑒定

在給予復方魚腥草合劑的大鼠血漿中初步鑒定出9個代謝產(chǎn)物，代謝途徑包括甲基化、葡萄糖醛酸結合和硫酸酯結合等，如圖2、3所示。

M1的準分子離子為 [M－H]?m/z181.050 6，確定分子式為C9H10O4，m/z181比咖啡酸的準分子離子（m/z179）多2（H2），并且表現(xiàn)出相同的碎片離子m/z135 [M－CH2O2－H]?，推測M1為咖啡酸的還原產(chǎn)物。

M3的準分子離子為 [M－H]?m/z355.069 2，其碎片離子m/z179為m/z355脫去葡萄糖醛酸（176）形成，與咖啡酸準分子離子相同，此外，m/z179再脫去CO2（44）形成碎片離子m/z135，這與咖啡酸裂解方式一致，推測M3為咖啡酸的葡萄糖醛酸結合物。

M4的準分子離子為 [M－H]?m/z273.006 0，確定分子式為C10H10O7S，脫去1分子硫酸酯基（80）形成 [M－SO3－H]?m/z193的碎片離子，提示經(jīng)過硫酸酯結合代謝途徑，又脫去CH2形成與咖啡酸的準分子離子相同的碎片離子，提示可能是經(jīng)過甲基化代謝途徑，推測M4為甲基化咖啡酸的硫酸酯結合物。以相似的方式，通過與原型成分的裂解規(guī)律進行對比，推測出M1～M7為咖啡酸代謝產(chǎn)物，代謝途徑包括了還原、甲基化、葡萄糖醛酸結合和硫酸酯結合等。

M8的準分子離子為[M－H]?m/z459.089 0，確定分子式為C22H20O11，與漢黃芩苷的分子式相同，比黃芩苷的準分子離子多14（CH2），脫去CH2形成[M－CH2－H]?m/z445的碎片離子，或脫去葡萄糖醛酸，形成 [M－C6H8O6－H]?m/z283的碎片離子，推測M8為黃芩苷的甲基化代謝產(chǎn)物。

M9的準分子離子為 [M－H]?m/z475.086 8，確定分子式為C22H20O10，碎片離子m/z460為母離子丟失CH3（15）而形成，說明結構里含有甲基，碎片離子m/z299為m/z475脫去葡萄糖醛酸（176）形成，m/z283為m/z299脫去O（16）形成，且與漢黃芩素準分子離子相同，提示可能是經(jīng)過羥基化代謝途徑，推測M9為漢黃芩苷的羥基化代謝產(chǎn)物。

4 討論

本實驗在正、負離子模式下對樣品均進行了檢測分析，體外樣品在正、負離子模式下均顯示出峰，但負離子響應更高，血漿樣品在負離子模式下的基質響應更低，而峰數(shù)量未有明顯變化，故選用負離子模式。考察了大鼠取血時間，分別在0.5、1、2 h進行了血漿采集，發(fā)現(xiàn)在1 h的血漿樣品中獲得的原型成分和代謝物較多，因此選用1 h的血漿樣品進行分析。在血漿樣品處理過程中考察了甲醇沉淀蛋白法和乙腈沉淀蛋白法，使用甲醇沉淀蛋白可降低基質的干擾，提高儀器靈敏度，故使用甲醇沉淀蛋白法。對流動相的選擇，比較了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，使用乙腈可以縮短保留時間，提高分離度，優(yōu)化峰形，使用0.1%甲酸水可使黃酮類成分響應變高，更易被檢測出，故選用乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

以咖啡酸和綠原酸為代表的有機酸類成分是復方魚腥草合劑中的重要成分，綠原酸可以在腸道菌群的作用下被水解為咖啡酸[10-11]，咖啡酸具有廣泛藥理活性，研究表明咖啡酸及其衍生物具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、抗菌和抗病毒等多種重要的藥理作用[12-13]，這可能是復方魚腥草發(fā)揮清熱解毒功效的原因之一，并且咖啡酸入血迅速，并在體內發(fā)生廣泛的代謝[14-15]，產(chǎn)生多種類型的代謝產(chǎn)物，如甲基化、硫酸結合和葡萄糖醛酸結合等，本實驗中檢測到了7個咖啡酸相關代謝物，代謝途徑與文獻報道基本一致，其中M7可能是其它原型成分經(jīng)過相關代謝而形成，但由于僅靠質譜數(shù)據(jù)無法確定其結構，而M7的分子式與咖啡酸相同，碎片也大致相似，因此M7被推測成咖啡酸的異構化產(chǎn)物。復方魚腥草合劑中含量最多的成分是以黃芩素和黃芩苷為代表的黃酮醇和黃酮苷類成分[16-17]，雷奇林等[18]用網(wǎng)絡藥理學的方法探究黃芩抗炎的作用機制，結果表明黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等黃酮類成分通過MAPK14、EGFR、TNFRSF1A、SELE等靶點抑制炎癥因子的產(chǎn)生、抑制炎癥因子與相應受體結合、阻斷炎癥反應的啟動等，最終發(fā)揮抗炎效應。這可能是復方魚腥草合計發(fā)揮抗炎作用的原因之一。此外，黃芩苷等黃酮類成分的代謝被廣泛報道[19-22]，黃芩苷和黃芩素等成分經(jīng)結腸吸收入血[23]，在腸道菌群作用下可以發(fā)生多種代謝途徑，黃芩苷和漢黃芩苷均可以發(fā)生脫糖化，形成相應苷元被吸收入血，而在血中黃芩素可以發(fā)生葡萄糖醛酸化、雙葡萄糖醛酸化和甲基化，漢黃芩素可以發(fā)生去甲基化和葡萄糖醛酸化。本實驗中，黃芩苷和漢黃芩苷的相關代謝物被少量檢測出，這可能是由于復方魚腥草合劑作為1個復方制劑，藥味多，所含化學成分復雜，各個成分在吸收入血過程中可能形成競爭或協(xié)調作用，黃芩苷等成分在在腸道和血漿代謝的過程中受到其他成分影響，而未表現(xiàn)出與單味藥或單個成分相的多種代謝途徑。

在口服給予復方魚腥草合劑后的大鼠血漿中初步鑒定出24個化學成分，包括15個原型吸收成分和9個代謝產(chǎn)物，來自于魚腥草、黃芩和金銀花等藥材，主要為黃酮類和有機酸類成分，代謝途徑主要為Ⅱ相代謝，包括甲基化、葡萄糖醛酸結合和硫酸酯結合等。這些原型成分和代謝產(chǎn)物，可能是復方魚腥草合劑潛在的活性成分，為其Q-Marker的確定奠定了基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突