基于指紋圖譜、化學計量學、網絡藥理學的半夏湯洗前后質量評價

張夢晨，謝 輝，陸兔林，何 暢，毛春芹，馮 飛，蔣孝峰

南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210046

半夏系天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，辛溫，歸肺、脾、胃經；可燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結。臨床用于濕痰寒痰、咳喘痰多、痰飲眩悸、風痰眩暈、痰厥頭痛、嘔吐反胃、胸脘痞悶、梅核氣等病證的治療[1]。半夏是臨床常用有毒中藥，《神農本草經》將其列為下品，內服時均以炮制品入藥。吳皓[2]研究并分析了漢代至宋代半夏的炮制方法沿革，結果表明湯洗、姜制是半夏的基本炮制方法，也是其他諸多半夏炮制工藝演變的基礎。

《傷寒雜病論》中含有半夏的42首方劑中，半夏下方標注“洗”字共18首[3]，占含半夏方劑數的42%，可見湯洗半夏的使用頻率之高。2018年4月國家中醫藥管理局發布了《古代經典名方目錄（第一批）》，其中含半夏的9首漢代仲景方中5首明確標注半夏的炮制方法為“洗”。張仲景在《金匱玉函經·方藥炮制》中給出“洗”的解釋：“凡半夏不咀，以湯洗十數度，令水清滑盡。洗不熟有毒也。”關于“湯”的界定，《說文解字》曰：“湯，熱水也”。半夏湯洗即將半夏藥材置于新沸的熱水中反復泡洗至洗后的水清澈、半夏表面無涎滑物質。有研究表明，半夏經過“湯洗”后對黏膜的刺激性降低[4]。

項目組在前期對半夏瀉心湯、旋覆代赭湯、黃連湯[5-6]等經典名方開展的研究工作中發現，由于制劑成分復雜，半夏在制劑中尚缺乏有效的質量評價手段，因此完善半夏藥材及湯洗飲片的質量評價方法，控制藥材及飲片質量，配合制劑過程管理，有助于建立含有半夏飲片的復方制劑質量控制體系。

指紋圖譜技術常用于表征中藥化學成分的整體性、復雜性和成分變化的差異性，本研究采用HPLC法構建指紋圖譜，結合主成分分析（principal component analysis，PCA），對國內主要產區半夏進行分析與評價；同時，采用模式識別方法對湯洗前后半夏進行判別分析，探尋半夏湯洗前后化學成分變化，以期發現和明確區分半夏及湯洗半夏的質量控制指標。進一步結合網絡藥理學分析相應成分所涉及的靶點與通路，為半夏的質量控制及后續開發研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，含2998 DAD檢測器，全自動進樣器，Empower液相色譜工作站，上海沃特世科技有限公司；TGL-16C高速離心機，上海安亭科學儀器廠；CAV64C電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥

乙腈、甲醇，色譜純，美國天地有限公司；水為超純水。對照品次黃嘌呤（批號140661-201704，質量分數100.0%）、黃嘌呤（批號140662-200802，質量分數98.0%）、尿苷（批號110887-201803，質量分數99.5%）、腺嘌呤（批號110886-201102，質量分數99.4%）、琥珀酸（批號110896-201602，質量分數98.0%）、肌苷（批號140669-201606，質量分數98.0%）、鳥苷（批號111977-201501，質量分數93.6%）、腺苷（批號110879-201703，質量分數99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品胸苷（批號18042703，質量分數98.0%）購自南京金益柏生物科技有限公司。

13批半夏藥材經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定，均為天南星科半夏屬植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，信息見表1。

表1 不同產地半夏藥材信息Table 1 Sample information of Pinelliae Rhizoma (PR)from different producing areas

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫：0～7 min，0～0.5%乙腈；7～20 min，0.5%～1.0%乙腈；20～25 min，1.0%～1.5%乙腈；25～40 min，1.5%～5.5%乙腈；40～45 min，5.5%～10.0%乙腈；45～50 min，10.0%～15.0%乙腈；50～60 min，15.0%～26.0%乙腈；60～65 min，26.0%～60.0%乙腈；65～85 min，60.0%～100.0%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長260 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取本品細粉，約2 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，精密加入20 mL超純水，稱定質量，超聲45 min，放冷，超純水補足減失的質量，濾過，離心，取上清液，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、胸苷、腺苷、琥珀酸對照品適量，加入適量超純水，配制成質量濃度分別為113.2、46.6、77.8、109.4、45.2、27.5、191.0、195.5 μg/mL的混合對照品溶液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，連續進樣6次，以9號峰（尿苷）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示各項RSD值均小于3%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.4.2 重復性試驗 按“2.2”項下方法制備供試品溶液（S1）6份，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，進行6次平行測定，以9號峰（尿苷）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示各項RSD值均小于3%，表明該方法具有良好的重復性。

2.4.3 穩定性試驗 精密稱取樣品（S1），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、16、24 h按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以9號峰（尿苷）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果顯示各項RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 半夏藥材指紋圖譜研究

2.5.1 指紋圖譜的建立及主要色譜峰的指認 取13批半夏樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將260 nm處色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012版），設定S1樣品色譜圖為參照圖譜，采用平均數法，進行多點校正和色譜峰匹配，經全峰匹配后得到半夏的共有模式圖和指紋圖譜疊加圖，見圖1-A、B，S1～S13相似度計算結果分別為0.990、0.991、0.996、0.988、0.975、0.984、0.951、0.980、0.981、0.988、0.974、0.983、0.969，相似度為0.951～0.996。取“2.3”項下的對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到對照品溶液液相色譜圖，見圖1-C。

圖1 13批半夏藥材的HPLC指紋圖譜 (A)、共有模式圖(B) 和混合對照品HPLC圖 (C)Fig.1 HPLC fingerprint (A) and common pattern (B) of 13 batches of PR and HPLC of mixed reference substances (C)

本研究建立了半夏藥材的指紋圖譜，共標記20個共有峰，經對照品保留時間及紫外吸收圖譜指認，確定7～10、13、14、20號色譜峰分別為次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷和琥珀酸。尿苷的色譜峰（9號峰）保留時間適中，峰形對稱，分離度較好，故以其作為參照峰，計算得到各共有峰保留時間的RSD＜0.76%，表明各色譜峰出峰穩定。分別為將各個共有峰的峰面積相對于參照峰的峰面積進行量化，得到20×13階數據矩陣，見表2。由于不同批次的半夏中肌苷含量差異較大且峰面積較小，色譜圖中肌苷對應的色譜峰（i號峰）未被指認作為半夏指紋圖譜的共有峰。

表2 13批半夏藥材共有峰相對峰面積Table 2 Relative peak area of 13 batches of PR

2.5.2 PCA PCA將多個變量轉化為少數幾個綜合變量（即主成分），是一種有效的降維統計方法，該方法消除了評價指標間的相關影響，有助于更客觀地描述樣品的相對地位，這對于半夏藥材質量的綜合評價具有重要意義。采用SPSS21.0統計軟件，將13批樣品中20個成分的相對峰面積組成矩陣，數據經標準化處理后進行PCA。PCA中特征值及貢獻率見表3。由表3可見，前5個主成分的特征值均大于1，表明前5個主成分在半夏藥材質量評價中起主導作用，5個主成分的累積貢獻率達90.928%（＞90%），能較客觀地反映不同產地半夏藥材的綜合質量，故選取前5個主成分進行分析。

表3 旋轉后的主成分特征值及貢獻率Table 3 Rotated eigenvalue of principal component and contribution rate

每個主成分包含的各因子其載荷系數綜合反映了所測成分對各主成分的影響。由表4可知，1、4、7（次黃嘌呤）、18、19、20（琥珀酸）號峰對主成分1有明顯的正負荷；12、16、17號峰是主成分2的主要決定因子，此外，10（腺嘌呤）號峰對主成分2有較強的逆負荷；6、11號峰的載荷因子在主成分3中較大；8（黃嘌呤）號峰是對主成分4影響較大的特征向量，此外，10（腺嘌呤）、15號峰對主成分2有較強對逆負荷；2、13號峰的載荷因子在第5主成分中較大，說明上述化合物對半夏藥材的品質影響較大，其余色譜峰對半夏藥材的品質影響較小。

表4 主成分荷載Table 4 Load matrix of principal component

不同產地半夏樣品的主成分各因子總得分見表5，可根據各主要因子的權重系數計算得出各樣品的綜合得分。權重系數依據其方差貢獻的大小計算，即各主成分的貢獻率與5個主成分的總貢獻率之比，主成分1的權重為36.864%/90.928%＝0.405 4，同理可得主成分2、3、4、5的權重分別為0.223 6、0.144 9、0.113 6、0.112 6。各主成分因子得分與其權重乘積之和相加，得出各半夏樣品的總因子得分（F），其表達式為F＝0.405 4F1＋0.223 6F2＋0.144 6F3＋0.113 6F4＋0.112 6F5，其值越高，綜合質量越好。結果顯示，S6批樣品（甘肅隴南）綜合質量最好，S12（江蘇泰州）綜合質量次之。

表5 不同產地半夏藥材的主成分因子及品質綜合評價Table 5 Principal component factors and comprehensive quality evaluation of PR from different producing areas

2.6 湯洗半夏指紋圖譜研究

2.6.1 湯洗半夏的制備 取凈半夏藥材，加水浸泡至內無干心后棄去全部水液，加入5倍量新沸的熱水，浸泡攪拌10 min，棄去水液及漂浮物，如此反復拌洗7次，取出，干燥，即得。13批半夏藥材S1～S13湯洗后對應飲片編號為T1～T13。

2.6.2 湯洗半夏指紋圖譜的建立 取13批湯洗半夏飲片，以“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將260 nm處色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”（2012版），設定S1樣品色譜圖為參照圖譜，采用平均數法，進行多點校正和色譜峰匹配，經全峰匹配后得到湯洗半夏飲片的指紋圖譜疊加圖和共有模式圖，見圖2，圖2中共有峰的編號系根據半夏藥材指紋圖譜中對應共有峰號編制。湯洗半夏飲片T1～T13相似度計算結果分別為0.978、0.977、0.993、0.993、0.940、0.988、0.995、0.984、0.983、0.997、0.961、0.989、0.991，相似度介于0.940～0.997。

圖2 13批湯洗半夏的HPLC指紋圖譜疊加圖 (A) 和共有模式 (B)Fig.2 HPLC fingerprint (A) and common pattern (B) of 13 batches of wPR

與半夏藥材相比，經湯洗處理后，指紋圖譜中某些共有色譜峰峰面積減小甚至消失，僅余11個共有峰，分別對應半夏藥材指紋圖譜共有峰中的3、4、6、7、9～11、14、17、18、20號峰。經對照品保留時間及紫外吸收圖譜指認，確定7、9、10、20號色譜峰分別對應為次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤和琥珀酸。分別為將各個共有峰的峰面積相對于參照峰（9號峰）的峰面積進行量化，得到11×26階數據矩陣，比較半夏及湯洗半夏共有峰的相對峰面積，結果見表6。

2.6.3 PCA 將13批半夏、湯洗半夏共有峰的相對峰面積導入SIMCA-P14.1軟件，以10個共有峰的相對峰面積為變量，PCA得分圖見圖3。半夏與湯洗半夏在主成分空間分布上均有特定區域，說明半夏與湯洗半夏化學成分存在顯著差異，能夠實現半夏與湯洗半夏的區分。

2.6.4 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）與差異性成分分析 在PCA的基礎上選擇有監督模式的OPLS-DA，模型主成分回歸系數：R2X＝0.683，R2Y＝0.724，Q2＝0.64＞0.5，說明預測模型有效，半夏與湯洗半夏可以得到有效區分，如圖4。模型得到變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值，見圖5。VIP值越大，即變量離X軸越遠，表明該色譜峰對于半夏與湯洗半夏的分類貢獻越大，也是導致半夏與湯洗半夏相區分的差異成分。其中VIP＞1的有4個色譜峰，依次為11、10、18、20號，其為導致差異的主要標志物。其中10號峰為腺嘌呤，20號峰為琥珀酸。其余色譜峰均＜1，對于區分半夏和湯洗半夏意義不大。

2.7 網絡藥理學研究

2.7.1 候選化合物靶點預測 核苷類成分和有機酸是半夏中主要的2類成分，已有許多研究報道證實這些成分是半夏的功效關聯物質[7-8]。檢索中藥系統藥理數據庫（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem Compound數據庫（https://www.ncbi.nlm.

nih.gov/pubmed/）、Swiss Target Prediction數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）中次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、胸苷、腺苷和琥珀酸8個化合物，候選化合物作用的靶點；并通過Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）將預測出的靶點蛋白名轉換為對應的基因名。將各數據庫篩選出的靶點蛋白合并，除去重復靶點，最終得到與8個化合物相關的229個靶點蛋白。

表6 半夏-湯洗半夏指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 6 Relative common peak area of PR and wPR

圖3 半夏與湯洗半夏PCA得分圖Fig.3 PCA score chart of PR and wPR

圖4 半夏與湯洗半夏OPLS-DA得分散點圖Fig.4 OPLS-DA scatter plot of PR and wPR

圖5 半夏、湯洗半夏指紋圖譜共有峰VIP值Fig.5 VIP values of fingerprint common peaks of PR and wPR

2.7.2 靶點蛋白與蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡分析 將獲得的229個靶點蛋白以gene symbol形式導入在線String 11.0軟件（https://string-db.org/cgi/input.pl），物種選擇為人（homo sapiens），最高置信度蛋白交互參數評分值＞0.9，其他參數設置不變，將得到的相互作用參數導入Cytoscape 3.6.0軟件構建PPI網絡圖，去掉網絡中的單一節點，見圖6。

圖6 PPI網絡Fig.6 PPI network

對PPI進行拓撲特征分析，選取在度中心性（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）3個參數均大于中位數且degree≥9的點作為核心靶點，經篩選后共得到9個重要核心靶點，具體包括MAPK1（degree 15）、RAC1（degree 10）、CASP3（degree 10）、MAPK3（degree 10）、CCND1（degree 9）、CDK2（degree 9）、SRC（degree 9）、PNP（degree 9）、EGFR（degree 9），且發現這9個靶點主要與腺苷、腺嘌呤、肌苷、尿苷、次黃嘌呤有關。

2.7.3 功能富集分析與通路分析 利用David 6.8數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對9個潛在的核心靶點蛋白進行交集靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到潛在靶點所富集的信號通路。GO分析以P＜0.05表示具有統計學意義。在GO富集分析中，共獲取19個GO條目，其中生物過程（biological process，BP）占10個，分子功能（molecular function，MF）占1個，細胞組成（cellular component，CC）占8個，選擇P值＜0.05的條目進行展示，GO分析結果提示BP顯著富集在長波紫外光（long wave ultraviolet ray，UV-A）反應、乳腺上皮細胞增殖、底物黏附依賴性細胞擴散和G1/S過渡有絲分裂細胞周期等過程；MF主要富集在ATP結合；CC主要富集在胞質、周期蛋白依賴的蛋白激酶全酶復合、早期內體膜等過程。具體信息見表7。

KEGG富集分析得到73條通路，結果見表8。選擇關聯基因數大于等于5的的條目進行展示，富集到16條通路主要涉及癌癥中的病毒致癌（viral carcinogenesis）、蛋白聚糖作用癌癥（proteoglycans in cancer）、癌癥通路（pathways in cancer）、乙型肝炎（hepatitis B）、黏著斑（focal adhesion）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路等，結果表明這9個核心靶點可能主要通過調控這些通路達到干預疾病的目的。

2.7.4 成分-靶點-通路網絡構建 根據上述成分-靶點、靶點-通路的對應關系，利用Cytoscape3.6.0軟件繪制出成分-靶點-通路網絡圖，并通過網絡圖進行可視化展示，見圖7。由網絡圖可知，半夏是通過多靶點、多途徑發揮協同作用的。根據Cytoscape3.6.0軟件分析結果，以化合物、靶點蛋白、信號通路的連接度（degree）為參考，發現化合物腺苷（degree 73）、肌苷（degree 38）的連接度較高，提示這2個化合物可能是半夏的活性成分，MAPK1（degree 16）、CCND1（degree 13）、ADORA1（degree 6）、ADORA2A（degree 6）、ADORA3（degree 5）、PNP（degree 5）的連接度高于其他靶點，表明這6個靶點發揮的作用可能更為關鍵，蛋白聚糖作用癌癥（degree 7）、癌癥通路（degree 7）、病毒致癌（degree 7）、PI3K-Akt信號通路（degree 6）、乙型肝炎（degree 6）、黏著斑（degree 6）連接度高于其他通路，表明半夏的7個關鍵成分主要對上述6條信號通路發揮重要作用。

表8 主要作用靶點的通路富集分析Table 8 Enrichment analysis of main target pathways

圖7 半夏成分-靶點-通路網絡Fig.7 Component-target-pathway network of PR

2.8 整合分析

半夏中含有生物堿類、有機酸類、核苷類、植物甾醇類、芳香酸類及半夏蛋白等多種成分，其中有機酸類和核苷類成分是半夏主要的活性成分之一，具有多種藥理作用[9]。1987年從半夏中分離出鳥苷[10]，1997年分離出胸苷[11]；2003年分離出次黃嘌呤核苷[12]。有研究表明，半夏經炮制成清半夏、姜半夏、法半夏飲片后，肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸含量明顯降低[13]，這與本研究中識別出的差異性成分相吻合。

MAPK信號轉導通路在細胞生長、分化、凋亡等進程中發揮關鍵作用[14]。細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CD1）經研究表明可促進細胞增殖，但其過度表達可致細胞增殖失控，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移[15]。過表達的CD1與肝細胞癌相關。綜上，推測半夏差異性成分可通過作用這些核心靶點發揮潛在的治療機制。與半夏中核苷類成分相關度較高的通路主要為蛋白聚糖作用癌癥、癌癥通路、病毒致癌、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎、黏著斑等。通過查閱相關文獻可知，半夏中總蛋白、多糖等成分對卵巢癌細胞、小鼠肉瘤瘤株S180、小鼠肝癌細胞H22、小鼠艾氏腹水癌細胞EAC等具有顯著的抑制作用[16-19]。半夏中的核苷類成分是否具有抑癌協同增效作用有待進一步研究證實。

3 討論

本實驗分別建立了半夏藥材和湯洗半夏飲片的HPLC指紋圖譜，并指認了其中7個共有峰，半夏藥材和湯洗半夏飲片的均具有較好的相似度，說明該方法簡便快捷，可以穩定可靠地應用于半夏的質量控制過程中。各主成分的載荷值綜合得分表明不同產地半夏藥材的綜合化學質量存在差異，且無明顯的地域性規律，這進一步說明由于受環境、生長年限等多因素的影響，造成了半夏化學質量的差異。經湯洗處理后其中11個共有峰的色譜數據經PCA和OPLS-DA篩選后得到4種差異性成分。采用網絡藥理學分析相關成分，結果表明它們具有廣泛的靶點和網絡通路，與半夏的主要藥理作用密切相關，為進一步實驗驗證、潛在藥理學機制及臨床拓展應用提供參考依據。

在文獻研究基礎上，指紋圖譜方法建立過程中對水、20%甲醇、50%甲醇3種提取溶劑進行比較，研究發現用水超聲提取45 min得到的供試液分離效果好且色譜峰數量較多；以水為提取溶劑，分離出來的成分極性較大，例如多糖類成分、核苷類成分。且超聲提取一次操作簡單，避免多重操作處理有助于降低精密度。

經文獻查閱[20-22]，同時進行190～410 nm波長下全波長掃描，發現在260 nm處各成分均有較強吸收，色譜峰相對較多，故選擇260 nm波長下進行指紋圖譜分析；對Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters C18XTerra（250 mm×4.6 mm，5 μm）、漢邦Hedera ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱進行了比較，結果表明Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對于極性成分分離效果最佳，可以最大限度地反映半夏化學成分組成的全貌。研究中還對柱溫、流動相流速、梯度洗脫程序進行了考察，最終確定了色譜條件。

來源不確定、各地炮制規范不統一、貯藏運輸不當使得中藥飲片的質量控制問題頻出[23]，本研究采用指紋圖譜技術對多個產地的半夏藥材開展質量研究，初步分析了湯洗前后半夏中的差異性成分，通過網絡藥理學初步篩選其潛在的作用靶點和網絡通路，有助于更快速地找到效應相關的質量標志物。未來還需借助適宜的化學分析技術、藥效學與毒理學技術和“譜-效-毒”關聯性分析研究，進一步闡明湯洗影響半夏臨床使用的有效性與安全性的科學內涵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突