在線中紅外光譜監(jiān)測(cè)熱毒寧注射液金銀花與青蒿醇沉過(guò)程7種指標(biāo)成分研究

徐芳芳，杜 慧，張 欣，李執(zhí)棟，徐 冰，朱文燈，吳 云，肖 偉*

1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

2.中成藥智能制造國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 連云港 222001

3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

熱毒寧注射液（Reduning Injection，RI）處方由青蒿、金銀花和梔子組成，臨床用于外感風(fēng)熱所致感冒、咳嗽，癥見(jiàn)高熱、微惡風(fēng)寒、頭痛身痛、咳嗽、痰黃；上呼吸道感染、急性支氣管炎見(jiàn)上述證候者[1-2]。金銀花和青蒿（金青）醇沉是熱毒寧注射液生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵工序之一，是金銀花和青蒿的水提濃縮液合并后加入乙醇從而除去蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、多糖等雜質(zhì)[3]而達(dá)到純化目的的過(guò)程。中藥醇沉機(jī)制復(fù)雜，過(guò)程質(zhì)量控制難度高，能否實(shí)現(xiàn)醇沉過(guò)程物料的快速分析對(duì)控制醇沉品質(zhì)至關(guān)重要[4]。

光學(xué)分析技術(shù)屬于無(wú)損、綠色檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)單、快速，廣泛應(yīng)用于中藥樣品中成分含量的快速測(cè)定[5-10]。杜文俊等[3]曾嘗試采用近紅外光譜法測(cè)定金青醇沉過(guò)程中綠原酸和固形物的含量，但由于醇沉?xí)r易出現(xiàn)粒徑不均的顆粒狀或絮狀樣品，在透射測(cè)定模式下直接影響近紅外定量預(yù)測(cè)的效果，該研究對(duì)象僅為醇沉上清液，近紅外技術(shù)的應(yīng)用是離線應(yīng)用，未能實(shí)現(xiàn)醇沉過(guò)程的在線控制[11]。

本研究采用在線中紅外光譜（mid-infrared spectrum，MIR）分析技術(shù)，采用衰減全反射設(shè)計(jì)，利用樣品表面的反射信號(hào)獲取樣品有機(jī)成分的結(jié)構(gòu)信息[12]，且其產(chǎn)生的基頻吸收強(qiáng)度大，靈敏度更高，更適用于混懸體系的樣品檢測(cè)。這不僅可以簡(jiǎn)化樣品的制備過(guò)程，還擴(kuò)大了紅外光譜技術(shù)的應(yīng)用范圍，測(cè)定多種狀態(tài)的樣品，例如生物組織、漿液等。目前紅外光譜技術(shù)在中藥檢測(cè)得到較為廣泛的應(yīng)用，如藥材鑒別[13-15]、品種分類[16-17]、偽劣鑒別[18]等定性分析方面有較多的研究應(yīng)用，而在中藥含量測(cè)定報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)利用衰減全反射-傅里葉變換MIR結(jié)合組合間隔偏最小二乘法（synergy interval partial least squares，SiPLS）[19-22]進(jìn)行變量篩選，分別建立熱毒寧注射液金銀花與青蒿（金青）醇沉過(guò)程7種指標(biāo)成分的偏最小二乘定量分析模型，實(shí)現(xiàn)新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷的快速測(cè)定。

1 材料與儀器

1.1 材料

9批次的金青醇沉過(guò)程樣本，批號(hào)及數(shù)量見(jiàn)表1，由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥現(xiàn)代化數(shù)字化提取工廠提供。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%）、梔子苷（批號(hào)110749-201806，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.5%），供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1 金青醇沉樣本信息Table 1 Information of Jinqing alcohol precipitation samples

1.2 儀器

Nicolet iS10紅外光譜分析儀、賽默飛U5高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；BSA224SCW型萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius公司；0.1 mL移液槍，德國(guó)Eppendorf公司；H1650型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

Unscrambler 11，挪威Camo Analytics公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 金青醇沉樣本取樣方法

為實(shí)現(xiàn)MIR在線獲取及樣本自動(dòng)采集，對(duì)醇沉設(shè)備取樣口位置進(jìn)行了適當(dāng)改造。打開(kāi)醇沉罐上部取樣口，插入一根套管，并固定其位置，光纖及探頭放于套管內(nèi)，探頭接觸醇沉罐中藥液；在套管內(nèi)再放入一根軟管，軟管與蠕動(dòng)泵相連，便于實(shí)時(shí)取樣。光纖及探頭信息：廠家Infrared Fiber Sensor，型號(hào)DiProbe，探頭長(zhǎng)度 28 cm，探頭直徑6 mm，光譜級(jí)鹵化銀光纖，光線長(zhǎng)度2.5 m。醇沉過(guò)程中紅外在線應(yīng)用見(jiàn)圖1。啟動(dòng)金青醇沉程序30 min后，每隔10 min取樣1次，至醇沉結(jié)束。金青醇沉樣品信息如表1所示，共計(jì)103個(gè)樣品。

圖1 醇沉過(guò)程在線中紅外應(yīng)用示意圖Fig.1 Schematic diagram of online MIR applying for alcohol precipitation process

2.2 MIR的采集

以空氣為掃描背景；光譜掃描范圍3400～700 cm?1；掃描次數(shù)16次；掃描間隔4 cm?1；根據(jù)樣本取樣時(shí)間推算樣本光譜采集時(shí)間，1 min內(nèi)連續(xù)的3張光譜的平均值，作為金青醇沉樣本光譜數(shù)據(jù)。MIR掃描結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2-A為103個(gè)樣品的光譜，圖2-B為Z181123批次中代表性樣品的光譜圖，取樣時(shí)間為45、65、85、105、125 min。

圖2 樣品 (A) 和Z181123批次中代表性樣品 (B) 的MIR光譜圖Fig.2 Mid-infrared spectra of samples (A) and typical samples spectra of batch Z181123 (B)

光譜隨著醇沉工藝的進(jìn)行有變化，但是差異不明顯。因中紅外檢測(cè)對(duì)象是醇沉上清液，上清液中溶劑是水和乙醇的混合液，溶劑濃度的變化及有效成分的含量變化未導(dǎo)致近紅外峰形有很大差異。

2.3 金青醇沉過(guò)程中7種指標(biāo)含量的測(cè)定

依據(jù)企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用一測(cè)多評(píng)法[23]，以綠原酸為參照，測(cè)定金青醇沉樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C的含量；以梔子苷為參照，測(cè)定金青醇沉樣品中斷氧化馬錢子苷的含量。

色譜條件：色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，15%～18%乙腈；5～15 min，18%乙腈；15～38 min，18%～31%乙腈；38～38.5 min，31%～90%乙腈；38.5～40 min，90%乙腈；40～41 min，90%～15%乙腈；41～45 min，15%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為327、238 nm；進(jìn)樣體積10 μL。所有樣本中7種指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 所有樣品指標(biāo)成分的含量Table 2 Statistics of content determination values of index components of all samples

2.4 校正集與驗(yàn)證集的劃分

本研究共收集9批數(shù)據(jù)，共計(jì)103個(gè)樣品。其中93個(gè)樣本用于MIR定量模型的建立，該部分樣本以3∶1比例進(jìn)行校正集與預(yù)測(cè)集的劃分，校正集樣本70個(gè)，預(yù)測(cè)集樣本23個(gè)，剩余10個(gè)樣作為外部驗(yàn)證集。

2.5 光譜預(yù)處理

MIR不僅能反應(yīng)樣本的化學(xué)組成與濃度，同時(shí)也受樣本的黏度、粒度、表面紋理、密度等物理性質(zhì)[11]及雜散光、探頭的材質(zhì)、光的散射的影響。因此，為了建立價(jià)位準(zhǔn)確的定量模型，應(yīng)該用適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理方法來(lái)消除背景噪音及特定的物理因素的干擾，提高譜圖與化學(xué)成分之間的相關(guān)性。常用的預(yù)處理方法有多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normal variate transformation，SNV）、Savitzky-Golay平滑（Savitzky-Golay smoothing，S-G平滑）、歸一化、基線校正、光譜轉(zhuǎn)換（spectroscopic transformation）、分位數(shù)歸一化（quantile normalization）等。

為了降低噪聲、提高信噪比，改善光譜數(shù)據(jù)，本實(shí)驗(yàn)選擇上述光譜預(yù)處理方法對(duì)7種指標(biāo)成分的光譜進(jìn)行預(yù)處理，然后結(jié)合偏最小二乘法建立這7種指標(biāo)成分的定量模型。根據(jù)模型評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選光譜預(yù)處理方法，以預(yù)測(cè)相對(duì)偏差（relative standard error of prediction，RSEP）為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，RSEP值越小越好，決定系數(shù)R2c與R2p越大越好，校正集誤差均方根（root mean square error of calibration，RMSEC）與交叉驗(yàn)證集誤差均方根（root mean square error of cross validation，RMSECV）越小越好。光譜預(yù)處理結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)處理方法的模型性能參數(shù)Table 3 Model performance parameters of different spectral pretreatment methods

續(xù)表3

從分析結(jié)果看，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷分別以基線校正、無(wú)預(yù)處理、分位數(shù)歸一化、無(wú)預(yù)處理、無(wú)預(yù)處理、無(wú)預(yù)處理、光譜轉(zhuǎn)換進(jìn)行光譜預(yù)處理時(shí)，RSEP值最小，R2c與R2p值較大，RMSEC與RMSECV值較小，因此采用上述方法進(jìn)行光譜預(yù)處理。

2.6 光譜波段的選擇

選擇最佳的光譜波段，是保證模型穩(wěn)健、準(zhǔn)確的關(guān)鍵，它可以剔除光譜數(shù)據(jù)中無(wú)用的信息，能夠有效提高模型的準(zhǔn)確性和有效性。SiPLS法主要用于偏最小二乘建模的波段篩選。將相關(guān)性較大的幾個(gè)波段進(jìn)行組合，以組合模型的RMSEC值作為判斷模型精度的標(biāo)準(zhǔn)，得到最佳組合波段區(qū)間。其優(yōu)點(diǎn)縮小了波段范圍，減小了波段優(yōu)選的工作量，避免中紅外建模過(guò)程中波段篩選的盲目性。本實(shí)驗(yàn)使用SiPLS法選擇波段區(qū)間。將整個(gè)光譜等分為20個(gè)等寬的子區(qū)間。最大潛變量因子20，組合數(shù)3。以RMSEC值大小作為選擇最佳檢測(cè)波段的標(biāo)準(zhǔn)，其中RMSEC值越小，意味所選波段最佳。光譜篩選結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 光譜波段篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of spectral bands

對(duì)于金青醇沉7種指標(biāo)成分特征波段選擇結(jié)果如下：新綠原酸組合區(qū)間為［13，16，19］，即最佳波段區(qū)間為835～725、1224～1099、1598～1377 cm?1；綠原酸組合區(qū)間為［1，8，12］，即最佳波段區(qū)間為3100～2975、2223～2098、1723～1599 cm?1；隱綠原酸組合區(qū)間為［8，15，18］，即最佳波段區(qū)間為2223～2098、1348～1224、974～849 cm?1；異綠原酸A組合區(qū)間為［1，7，12］，即最佳波段區(qū)間為3100～2975、2347～2223、1723～1599 cm?1；異綠原酸B組合區(qū)間為［15，16，19］，即最佳波段區(qū)間為1348～1224、1224～1099、849～725 cm?1；異綠原酸C組合區(qū)間為［15，16，18］，即最佳波段區(qū)間為1348～1224、1224～1099、973～849 cm?1；斷氧化馬錢子苷組合區(qū)間為［8，9，12］，即最佳波段區(qū)間為2223～2098、2098～1973、1723～1599 cm?1。

7種指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示，紅外光譜的9個(gè)重要區(qū)段如表4所示，綜合SiPLS篩選結(jié)果分析可知，新綠原酸和隱綠原酸的特征波段共有區(qū)段相似，它們的特征波段中都具有不飽和碳?xì)涿嫱鈴澢駝?dòng)、C-O的伸縮振動(dòng)及C-H、O-H的各種面內(nèi)彎曲振動(dòng)的光譜信息；綠原酸和異綠原酸A的特征波段共有區(qū)段相同，它們的光譜有效信息主要來(lái)自于不飽和碳?xì)?、C＝O、C＝C的伸縮震動(dòng)。異綠原酸B和異綠原酸C的特征波段共有區(qū)段相同，它們的光譜有效信息主要來(lái)自于不飽和碳?xì)涿嫱鈴澢駝?dòng)、C-O的伸縮振動(dòng)及C-H、O-H的各種面內(nèi)彎曲振動(dòng)。斷氧化馬錢子苷的光譜有效信息主要來(lái)自于C＝O、C＝C的伸縮震動(dòng)。上述篩選結(jié)果說(shuō)明，SiPLS法識(shí)別的指標(biāo)成分的光譜信息具有代表性，是MIR定量模型建立過(guò)程的一種有效方法，篩選的特征波段與指標(biāo)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)具有高度相關(guān)性。

圖4 7種指標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structures of seven indicator components

表4 紅外光譜的9個(gè)重要區(qū)段Table 4 Nine important segments of infrared spectrum

2.7 模型建立

通過(guò)SiPLS法找到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷這7種成分的特征波段，依據(jù)這7種成分的特征波段結(jié)合偏最小二乘法建立中紅外的定量模型，7種指標(biāo)成分建模結(jié)果表5所示。

表5 7種指標(biāo)成分的模型性能參數(shù)Table 5 Model performance parameters of seven index components

從模型的預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷的模型預(yù)測(cè)誤差均小于10%。特征波段所建立的定量模型對(duì)熱毒寧注射液金青醇沉階段新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷的預(yù)測(cè)均有較好的效果。

2.8 模型外部驗(yàn)證

模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性需用外部驗(yàn)證集樣本來(lái)驗(yàn)證。根據(jù)一測(cè)多評(píng)法所測(cè)各指標(biāo)成分的實(shí)測(cè)值與樣本預(yù)測(cè)值，計(jì)算相對(duì)誤差。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷模型預(yù)測(cè)值與樣本實(shí)測(cè)值的絕對(duì)誤差及相對(duì)誤差見(jiàn)表6，結(jié)果顯示這7種指標(biāo)成分的平均相對(duì)誤差均小于10%。

表6 驗(yàn)證集樣本預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的對(duì)比Table 6 Comparison of prediction values and measured values of model validation samples

3 討論

本研究以熱毒寧注射液醇沉過(guò)程中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C和斷氧化馬錢子苷共7個(gè)成分為考察對(duì)象，采用SiPLS法篩選MIR，得到特征波段，并基于此建立了中紅外定量模型。結(jié)果顯示，所建立的中紅外監(jiān)測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確。

醇沉過(guò)程是中藥生產(chǎn)過(guò)程的純化除雜方法，目前我們對(duì)于醇沉工藝過(guò)程的認(rèn)識(shí)不太深入，對(duì)于過(guò)程中各工藝參數(shù)對(duì)質(zhì)控指標(biāo)的影響的理解較為薄弱，采用常規(guī)技術(shù)難以理解過(guò)程工藝參數(shù)的波動(dòng)對(duì)醇沉上清液質(zhì)量的影響，造成醇沉上清液批次間的質(zhì)量波動(dòng)，存在質(zhì)量控制風(fēng)險(xiǎn)。MIR技術(shù)可很好適應(yīng)中藥醇沉機(jī)理和混合體系工況復(fù)雜的情況，能實(shí)現(xiàn)醇沉過(guò)程物料的快速檢測(cè)，為熱毒寧注射液醇沉工序在線監(jiān)控奠定基礎(chǔ)，也為中藥醇沉過(guò)程實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)提供技術(shù)支持，拓展了中藥生產(chǎn)在線質(zhì)量控制手段。MIR技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，生產(chǎn)過(guò)程模型的穩(wěn)定性和傳遞性，是應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注與維護(hù)的地方。后期需定期更新用于模型建立的樣本集，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，不斷提高該模型的穩(wěn)健性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突