基于熵權法和正交設計優化加減當歸芍藥散揮發油的β-環糊精包合工藝

成余勤，石森林，來平凡

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

當歸芍藥散最早見于漢代張仲景所著《金匱要略》，具有養血疏肝、健脾利濕的功效，古人用于治療“婦人雜病腹中諸疾痛”[1]。現代中醫常以此方為基礎治療原發性痛經，具有良好的效果[2-3]。方中用當歸活血養血，川芎行氣補血，白芍斂陰補血兼止腹痛，三藥伍之共奏補血養肝之效，為主藥；白術味苦而甘，健脾燥濕安胎；茯苓滲濕健脾寧心，澤瀉淡慘利濕消腫，二藥共協白術健脾去濕。茯苓、白術、澤瀉逐水氣利小便，針對的是婦人懷妊，腹中疞痛的情況，因此加減當歸芍藥散（modified Danggui Shaoyao San，MDSS）在原方的基礎上，減去白術、茯苓和澤瀉，加入延胡索、香附和吳茱萸，使其著重于治療原發性痛經，方中延胡索活血、行氣、止痛，香附疏肝解郁、理氣寬中、調經止痛，吳茱萸散寒止痛。同時，現代研究表明延胡索中的延胡索乙素可通過抑制子宮收縮起直接鎮痛作用[4]，香附中的α-香附酮已被證明為鎮痛和抗子宮痙攣的活性化合物[5-6]，吳茱萸中的吳茱萸堿可舒張子宮平滑肌，恢復產熱機能，達到活血止痛的目的[7-8]，前期研究表明MDSS對痛經模型小鼠確有療效。

當歸揮發油中的主要成分藁本內酯[9]，具有鎮痛[10]、抗癌、抗炎、抗氧化等藥理作用[11]；川芎揮發油的主要成分藁本內酯和丁基苯肽[12]具有解熱、鎮痛、鎮靜、改善血流變、保護神經細胞、抗炎、降壓等多種藥理作用[13]；香附揮發油的主要成分香附酮和香附烯[14]，具有鎮痛、抗炎等作用[15]。在形成制劑時，揮發油的傳統加入方式為噴入，在揮發油得率原本就不高的情況下由于揮發油易揮發的特性，進一步增加了揮發油的損失。MDSS揮發油其中1個主要藥效成分藁本內酯，其化學結構存在多個雙鍵構成的高度不飽和共軛體系，此結構特性決定其穩定性較差，在提取、分離、純化和貯存過程中均極易發生氧化、聚合等降解反應[16-17]。因此，本實驗采用現階段常用的β-環糊精包合技術固化揮發油[18-19]，以增加揮發油的穩定性。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

川芎（產地為四川，批號200601）、醋香附（產地為浙江，批號200601）、當歸（產地為甘肅，批號200701），浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司；所有飲片均經浙江中醫藥大學來平凡教授鑒定，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，香附為莎草科莎草屬植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖，當歸為傘形科當歸屬植物當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根。硅膠板，青島海洋化工廠分廠；β-環糊精，批號Z30M10Y89545，上海源葉生物科技有限公司；正己烷，批號20120703，杭州石化有限責任公司；醋酸乙酯，批號20200902，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Nicolet IS50紅外分光光度計，美國賽默飛世爾科技有限公司；ZF-I型三用紫外分析儀，上海顧村電光儀器廠；S-3000N E-1010掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司；XRD-6100 X射線衍射儀，日本島津公司；CP313電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；XS105分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KH-250DB型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；DFY-500高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；DNG-5070A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取

根據實驗室前期研究，確定揮發油提取工藝為按10倍處方量稱取川芎75 g，當歸45 g，香附60 g，加入9倍藥材用量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及中藥飲片用量1.0%的果膠酶，在46 ℃下酶解30 min后，水蒸氣蒸餾法提取4 h，得到1.238 g MDSS總揮發油。

2.2 空白回收率、包合率、得率的測定

2.2.1 揮發油空白回收率測定 稱取總揮發油約0.5 g，精密稱定，共計3份，分別置500 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300 mL連接揮發油提取器，提取揮發油4 h，計算揮發油提取平均空白回收率為73.21%，RSD為1.42%。

2.2.2 揮發油包合率測定 稱取適量包合物約3 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入300 mL水，按“2.2.1”項下提取揮發油并測定揮發油質量，計算包合率。

揮發油包合率＝包合物中提取揮發油量/(空白回收率×加入揮發油量)

2.2.3 包合物得率測定 包合物制備完成后計算其得率。

包合物得率＝包合物實際質量/(β-環糊精質量＋揮發油質量)

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗因素、水平確定 飽和水溶液法包合揮發油一般受β-環糊精用量、包合溫度、包合時間等因素的影響，通過參考文獻及預實驗，采用正交試驗法，以揮發油包合率為考察指標，β-環糊精用量與揮發油比例（A）、包合溫度（B）、包合時間（C）為考察因素[18-21]，每個因素選擇3個水平，利用L9(34)正交表進行正交試驗。其因素水平安排見表1。

2.3.2 正交試驗設計 以包合率、包合物得率為評價指標，其中包合率作為主要指標，權重系數為0.604 6，包合物得率作為次要指標，權重系數為0.395 4，按“2.3.3”項下計算綜合評分，結果見表1。

表1 正交實驗設計與結果Table 1 Experimental design and results of orthogonal test

2.3.3 信息熵法確定權重系數 信息熵是系統不確定性和無序程度的度量，除了度量數據包含的信息量，還可用于在多指標評價系統中用來確定各指標權重。該法是將每個評價指標作為1個隨機變量，計算該指標的熵權系數，其取值變異程度越大，越無序，提供的信息量越多，該指標就越重要；反之該指標就越不重要。用熵權法確定權重的計算步驟如下。

（1）原始數據矩陣歸一化，建立原始評價指標矩陣：現有m個待評項目，n個評價指標，形成原始數據矩陣R＝(rij)m×n，其中rij為第j個指標下第i個項目的評價值，即建立正交中9次試驗的包合物得率和揮發油包合率矩陣。

（2）將原始數據矩陣(Rij)m×n轉化為概率矩陣(Pij)m×n，在信息熵公式中Pij為某個信息的概率，滿足0≤Pij≤1，因此必須先對矩陣(Rij)m×n做歸一化處理，經處理后的矩陣可視為評價指標的概率矩陣，其中Pij表示第j個指標下第i個項目的概率。

（3）計算指標的熵值，確定第j個指標的信息熵（Hj）。包合物得率及包合率的信息熵分別為0.720 8和0.573 1。

當Pij＝0時，考慮到lnPij無意義，因此，對Pij的計算進行修正，將其定義為

（4）計算指標的熵權系數（Wj）。包合物得率及包合率的熵權系數分別為0.395 4、0.604 6。

（5）綜合評分（Y）的計算。

Y＝包合物得率/包合物得率最大值×100×0.395 4＋揮發油得率/揮發油包合率最大值×100×0.604 6

2.3.4 結果分析 由表2可知，各因素影響程度依次為C＞A＞B，因素A、B、C均對包合效果有顯著影響（P＜0.05）。因此，確定最優包合工藝為A2B2C3，即揮發油與β-環糊精比例1∶10，包合溫度40 ℃，攪拌時間2 h。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.3.5 驗證試驗 由于正交試驗得出的最優包合工藝條件中包合時間2.0 h為最高水平，因此對包合時間進行了考察。試驗結果見表3，包合2.5 h時，包合物得率及揮發油包合率分別為65.23%、79.16%，包合3.0 h時，包合物得率及揮發油包合率分別為65.67%、80.86%。由結果可知，包合時間為3.0 h時，包合效果最好，但包合物得率及揮發油包合率增幅均較小，考慮到時間及資源成本，決定包合時間仍為2.0 h。

表3 包合時間對環糊精包合的影響 (±s,n=3)Table 3 Effect of inclusion time on cyclodextrin inclusion(±s ,n=3)

表3 包合時間對環糊精包合的影響 (±s,n=3)Table 3 Effect of inclusion time on cyclodextrin inclusion(±s ,n=3)

包合時間/h 包合物得率/% 包合率/%2.0 64.56±0.76 80.44±0.64 2.5 65.23±0.08 79.16±0.40 3.0 65.67±1.03 80.86±0.71

按“2.3.4”項下確定的最優工藝進行3次驗證試驗，即稱取5 g β-環糊精置于100 mL具塞錐形瓶中，加入90 mL純化水，置于恒溫磁力攪拌器上50 ℃加熱溶解，待溶解完畢，將溫度降至40 ℃，緩慢滴加揮發油的95%乙醇（1∶1）溶液，繼續恒溫攪拌2 h，取出，置于冰箱中冷藏24 h，快速抽濾，5 mL 95%乙醇洗滌3次后40 ℃干燥5 h。試驗結果見表4，包合物的平均得率為64.56%，包合率為80.44%，綜合評分為95.94。表明該包合工藝穩定，可用于MDSS揮發油包合物的制備。

表4 驗證試驗結果Table 4 Results of verification test

2.4 包合物表征

2.4.1 外觀性狀 分別取揮發油包合物、揮發油與β-環糊精物理混合物、β-環糊精置于干凈的濾紙上，比較3者之間的區別。在第0天時，3者均為白色粉末狀物質、β-環糊精比包合物及物理混合物粉質細膩，如圖1所示；物理混合物有揮發油氣味，包合物及β-環糊精則無揮發油氣味。在第10、20天時，物理混合物變成淡黃色，可能的原因是揮發油不穩定，氧化或降解造成顏色加深形成淡黃色物理混合物，包合物及β-環糊精則仍為白色粉末狀。可初步確定揮發油包合物已形成，且揮發油包合后較未包合穩定。

圖1 揮發油包合物、揮發油與β-環糊精物理混合物、β-環糊精在不同時間點的外觀性狀Fig.1 Appearance of volatile oil β-CD inclusion complex,mixture of volatile oil and β-CD,and β-CD at different time points

2.4.2 TLC分析 分別稱取β-環糊精、包合物、物理混合物0.1 g，揮發油10 μL，加入1 mL甲醇，振搖后取上清。照薄層色譜法試驗，吸取上述溶液，分別點樣于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結果見圖2。解包后包合物及物理混合物斑點與揮發油一致，β-環糊精無相應斑點，表明揮發油包入β-環糊精空腔后主要成分無差異。

圖2 樣品TLC色譜Fig.2 TLC of samples

2.4.3 紫外光譜分析 稱取適量的β-環糊精、物理混合物、包合物及少量揮發油，溶于甲醇中。β-環糊精、物理混合物、包合物超聲提取30 min，取上清。將以上4種樣品在200～800 nm進行掃描，結果見圖3。β-環糊精的曲線平緩，僅在接近200 nm處有吸收。包合物超聲提取揮發油后，紫外吸收光譜與揮發油及物理混合物相似，表明包合前后，揮發油未發生改變。

圖3 紫外吸收光譜Fig.3 UV absorption spectrum

2.4.4 紅外光譜分析 取揮發油、β-環糊精、物理混合物、包合物適量，在波數4000～500 cm?1進行紅外特征測定，結果見圖4。由圖4可知，包合后2 927.39、1 762.16 cm?1等處的揮發油吸收峰已經消失或明顯減弱，而在物理混合物中仍然存在，表明揮發油進入β-環糊精空腔，其紅外振動受到限制。包合物特征峰與β-環糊精相似，峰形相同，物理混合物整體紅外吸收特征與β-環糊精相似，在物理混合物中1 765.20、1 663.09 cm?1處的吸收峰為揮發油的特征峰，表明其紅外圖譜是由吸收較強的β-環糊精紅外圖譜與吸收較弱的揮發油紅外圖譜加和而成的。

圖4 樣品紅外光譜Fig.4 Infrared spectrum of samples

2.4.5 X射線衍射分析 測試條件為Cu靶（40 kV，40 mA）；步進掃描0.02°/步；掃描范圍10°～80°；掃描速度2°/min。分別對β-環糊精粉末、揮發油與β-環糊精物理混合物（1∶10）和β-環糊精包合物3組樣品進行XRD分析。結果見圖5，β-環糊精在10°～35°有多個強的結晶特征衍射峰，且物理混合物的特征衍射峰與β-環糊精基本一致，說明β-環糊精仍以原晶體形式存在于物理混合物中。而在包合物中，衍射峰數量明顯減少，部分衍射峰加強或生成，與前兩者有顯著性差別。說明環糊精包合揮發油后，晶型發生顯著性改變，表明揮發油已包合在β-環糊精空穴中。

圖5 樣品X射線衍射圖Fig.5 XRD of samples

2.4.6 SEM觀察 稱取一定量的β-環糊精、物理混合物和包合物置于蓋玻片上，在其表面真空鍍金后固定于銅板上，再通過SEM觀察各樣品的表面和晶體結構。由圖6可知，β-環糊精及物理混合物均為不規則的晶體結構，表面粗糙，凹凸不平，物理混合物與包合物相比小顆粒較少，多為團塊狀，這可能是因為揮發油黏度較大，與β-環糊精物理混合之后，將環糊精聚集在一起形成團塊狀。包合物則多為小顆粒狀，表面光滑，與β-環糊精相比，形態和晶型發生了重大變化，表明包合物已形成。

圖6 樣品掃描電鏡圖Fig.6 SEM of samples

3 討論

當歸芍藥散為張仲景調理肝脾的代表方劑，臨床上多采用其加減方治療原發性痛經[22]，對其進行加減后可使其治療原發性痛經療效更為確切。MDSS中當歸、川芎、香附揮發油含量較高且已有相關研究表明揮發油對痛經具有明顯藥效[10,13,15]。經實驗室前期研究發現MDSS揮發油中含有藁本內酯，其是一種極不穩定的化合物，因此需對揮發油進行包合，以增加其穩定性，便于儲存。目前，揮發油常用β-環糊精包合，包合方法有飽和水溶液法、研磨法以及超聲法，已有研究表明飽和水溶液法制備包合物的得率及包合率均顯著高于另外2種[20,23]，且制備工藝簡單，適合工業化生產。

本實驗以包合物得率及揮發油包合率為指標，運用熵權法結合正交設計優化揮發油包合工藝。熵權法確定評價指標權重可以避免主觀因素的影響，從而得出較為客觀的指標權重。由于包合因素及水平的確定是參考文獻，因此正交試驗確定的工藝包合時間2.0 h不夠科學和準確，可能存在包合時間大于2.0 h時，包合效果更好的情況。因此后續對包合時間進行了考察，分別考察了包合2.5 h及3.0 h時包合物得率及包合率，最終決定選擇包合時間為2.0 h。本研究通過對用飽和水溶液法制備包合物進行研究，得到制備工藝簡單，所需儀器設備較少的方法，故適合工業化大生產。該方法穩定、可行，為后續研究及產品開發提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突