芪珍膠囊抗結腸癌的作用機制研究

郭丹丹，郭鋮潔，桑婷婷，王玉潔，吳凱凱，郭翠玲，方 柳，王興亞

浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053

結腸癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，其發病率和死亡率高，轉移性結腸癌患者的5年生存率不超過10%[1-4]。目前，手術、化療、放療及靶向手段是治療結腸癌的主要策略。然而，這些傳統的治療方式具有術后并發癥、耐藥性及不良反應等局限性。近年來，中醫藥因其療效顯著、不良反應少而被廣泛用于防治癌癥。天然化合物或補充劑具有潛在的抗癌作用[5-6]。紫杉醇可以逆轉非小細胞肺癌干細胞對順鉑誘導的耐藥性[7]，對乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌、結腸癌和肺癌均有明顯的治療作用[8-9]。參麥注射液主要由紅參和麥冬組成，可通過改善化療藥物阿霉素和紫杉醇在小鼠體內的亞細胞分布，增強對結腸癌細胞的毒性[10]。康萊特?注射液（薏苡仁提取物）與吉西他濱聯用可顯著提高局部晚期或轉移性胰腺癌患者的無進展生存期[11]。金龍膠囊可抑制胃癌細胞增殖，并促進其凋亡[12]。

芪珍膠囊是一種有效的抗癌中藥制劑，臨床用于肺癌、乳腺癌和胃癌的輔助治療，主要由珍珠、黃芪、三七、大青葉和重樓組成，具有益氣化瘀、清熱解毒的功效。芪珍膠囊主要活性成分為黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1。芪珍膠囊與多西他賽或順鉑等化療藥物聯用，能夠協同抑制乳腺癌、晚期非小細胞肺癌、胃癌患者的腫瘤生長，提高患者免疫功能和生活質量[13-16]。芪珍膠囊可以增加乳腺癌患者CD4/CD8細胞，改善免疫功能，緩解放化療引起的骨髓抑制等不良反應[17]。目前，芪珍膠囊對結腸癌的作用及其抗腫瘤的作用機制尚不清楚。人結腸癌細胞HCT116是從結腸癌的男性患者中分離的惡性細胞株，由于其在無胸腺的裸鼠中具有較好致瘤性，可形成上皮樣腫瘤，被廣泛用于結腸癌研究[18]。本研究從體內外探究芪珍膠囊抗結腸癌的作用及機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 細胞

HCT116細胞購自美國ATCC。

1.2 動物

SPF級BALB/c雄性裸鼠60只，4周齡，體質量18～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SYXK2018-0012。動物飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，溫度（24±2）℃、濕度（50±10）%，保持良好通風，自由進食飲水。動物實驗經浙江中醫藥大學實驗動物管理與倫理委員會批準（批準號ZSLL-2018-015）。

1.3 藥品與試劑

芪珍膠囊（批號160908，0.3 g/粒）購自寧波大昌藥業有限公司，經高效液相色譜法測定每粒芪珍膠囊含4.85 mg三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1，符合《中國藥典》2015年版規定；氟尿嘧啶注射液（批號02170302，0.25 g/支）購自山西普德藥業有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、0.25%胰酶購自美國Gibco公司；MTT購自美國AMRESCO公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；β-actin抗體（批號4967S）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗體（批號9542S）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號2876S）、程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand 1，PD-L1）抗體（批號13684T）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（批號9665）、Caspase-9抗體（批號9508）、剪切型Caspase-9（cleaved Caspase-9）抗體（批號7237P）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號2983S）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（批號5536S）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抗體（批號2603S）、p-AMPK抗體（批號2535S）、細胞外信號調節蛋白激酶（extraeellular signal regulated kinase，ERK）抗體（批號9102S）、p-ERK抗體（批號4377）、p38抗體（批號9218S）、p-p38抗體（批號9211S）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體購自美國CST公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號23209）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；ECL顯影液（批號170-5061）、EASYspin組織/細胞RNA快速提取試劑盒（批號RN07）購自北京艾德萊生物科技有限公司；iTaqTM Universal SYBR Green Supermix（批號172-5124）購自美國BIO-RAD公司；PCR試劑盒（批號R2233-01）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；人重組γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ，批號071527-3）購自美國PEPROTECH公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號MM-0049H2）、IL-1β ELⅠSA試劑盒（批號MM-0181H2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號MM-0122H2）購自江蘇酶免實業有限公司；β-actin、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、TNF-α、IL-6、CD68、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、PD-L1引物購自上海生工生物技術有限責任公司。

1.4 儀器

CKX31SF倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；HYC-360型4 ℃醫用冷藏箱、DW-25L262型?20 ℃醫用低溫冷藏箱（青海海爾特種電器有限公司）；902型 ?80 ℃超低溫冰箱、3111型CO2培養箱、1300SERIES A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ELX808型酶標儀（美國BIOTEK公司）；GeneAmp 9700型基因擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；CFX96型實時熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀（美國BIO-RAD公司）；MiniChemiTM610型化學成像分析儀（北京賽智創業科技有限公司）；5424R型高速離心機、5404型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

HCT116細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養。

2.2 芪珍膠囊對HCT116細胞存活率的影響

取處于對數生長期的HCT116細胞，以1×104/mL接種于96孔板中，培養至細胞融合度為50%。芪珍膠囊溶于含10%胎牛血清的DMEM培養基，配制成質量濃度為2.1 mg/mL的母液，經0.22 μm濾膜濾過，使用時以DMEM培養基稀釋。設置對照組和芪珍膠囊（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）組，各給藥組加入200 μL相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，分別培養24、48、72 h，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h；每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩10 min，采用多功能酶標儀于490 nm測定吸光度（A）值，以空白對照孔的A值作為參照，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對照－A空白)

2.3 芪珍膠囊對HCT116細胞凋亡的影響

取處于對數生長期的HCT116細胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養至細胞融合度為50%。設置對照組和芪珍膠囊（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）組，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h，收集細胞，以含Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）的結合緩沖液重懸，避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，以早期凋亡細胞（Annexin V＋/PI－）和晚期凋亡細胞（Annexin V＋/PI＋）計算凋亡率。

2.4 芪珍膠囊對HCT116細胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表達的影響

按“2.3”項下方法處理細胞，收集細胞，加入RIPA裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，分別加入Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38、p-p38、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠IgG抗體（1∶2000），室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌4次，加入ECL顯影液，采用化學成像分析儀曝光并拍照。

2.5 芪珍膠囊對HCT116細胞PD-L1 mRNA表達的影響

按“2.3”項下方法處理細胞，按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：β-actin上游引物5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3’、下游引物5’-AAGGAACTTCCTTGAACAATGCA-3’；PD-L1上游引物5’-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3’、下游引物5’-AGCCCTCAGCCTGACATGTC-3’。

2.6 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型的影響

BALB/c裸鼠隨機分為對照組及芪珍膠囊低、高劑量（1.5、4.5 g/kg，分別相當于臨床2、6倍劑量）組、氟尿嘧啶（20 mg/kg）組、芪珍膠囊（1.5 g/kg）聯合氟尿嘧啶（20 mg/kg）組，每組12只。取處于對數生長期的HCT116細胞，將細胞密度調整為2.5×107/mL，于裸鼠背部sc 0.2 mL細胞懸液，7～10 d后，裸鼠皮下出現結節，表明移植瘤模型建立成功。芪珍膠囊溶于生理鹽水，分別配制成質量濃度為150、450 mg/mL的溶液；氟尿嘧啶以生理鹽水配制成質量濃度為2 mg/mL的溶液。自造模第2天開始，芪珍膠囊組ig相應藥物，對照組ig 0.2 mL生理鹽水，1次/d；氟尿嘧啶組ip藥物，每2天1次，連續5周。每周稱定各組裸鼠體質量，測量腫瘤長徑（a）及與長徑垂直的瘤體最寬徑（b），計算腫瘤體積。

腫瘤體積＝ab2/2

2.7 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

末次給藥24 h后，裸鼠用CO2窒息處死，心臟取血，血液室溫靜置至析出，4 ℃、3000 r/min離心15 min，吸取上清，按試劑盒說明書檢測各組裸鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

2.8 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表達的影響

裸鼠處死后，取腫瘤組織，稱定質量，按照試劑盒說明書提取各組裸鼠腫瘤組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：NF-κB上游引物5’-ATGGCTTCTATGAGGCTGAG-3’、下游引物5’-GTTGTTGTTGGTCTGGATGC-3’；TNF-α上游引物5’-AGAGGGAGAGAAGCAACTACA-3’、下游引物5’-GGGTCAGTATGTGAGAGGAAGA-3’；IL-6上游引物5’-CGTGGAAATGAGAAAAGAGTTGTG-3’、下游引物5’-CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTCT-3’；CD68上游引物5’-TTGGGTGAGGCGGTTCAGCCA-3’、下游引物5’-GTGCTCTCTGTAACCGTGGGTGT-3’；MCP-1上游引物5’-TGGCTGTGTTTGCTTCTGTC-3’、下游引物5’-TCTCACTGCCCTATGCCTCT-3’；iNOS上游引物5’-GGAAGCGGTAACAAAGGA-3’、下游引物5’-GCCAGCATAGCGGATG-3’；其余引物序列見“2.5”項。

2.9 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1蛋白表達的影響

取各組裸鼠腫瘤組織，加入500 μL RIPA裂解液，使用勻漿機充分破碎腫瘤組織，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。按“2.4”項下方法檢測各組裸鼠腫瘤組織PD-L1蛋白表達情況。

2.10 芪珍膠囊對IFN-γ誘導的HCT116細胞存活率的影響

取處于對數生長期的HCT116細胞，以1×104/mL接種于96孔板中，培養至細胞融合度為50%。設置對照組、模型組、芪珍膠囊（0.4、0.7 mg/mL）組、芪珍膠囊（0.4、0.7 mg/mL）聯合IFN-γ（10 ng/mL）組，模型組和聯合給藥組加入IFN-γ（10 ng/mL），各給藥組加入200 μL芪珍膠囊溶液，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h。按“2.2”項下方法測定各組細胞存活率。

2.11 芪珍膠囊對IFN-γ誘導的HCT116細胞PD-L1蛋白表達的影響

取處于對數生長期的HCT116細胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養至細胞融合度為50%。設置對照組、模型組和芪珍膠囊（0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL）組，模型組和各給藥組加入IFN-γ（10 ng/mL），各給藥組再加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h。按“2.4”項下方法檢測各組細胞PD-L1蛋白表達情況。

2.12 統計學方法

計量資料以±s表示，采用SPSS 19.0軟件及GraphPad Prism 5軟件進行數據分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或t檢驗對各組數據進行比較。

3 結果

3.1 芪珍膠囊對HCT116細胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組比較，芪珍膠囊組細胞存活率顯著降低（P＜0.01、0.001），呈劑量和時間相關性。

圖1 芪珍膠囊對HCT116細胞存活率的影響(±s ,n=3)Fig.1 Effect of Qizhen Capsule on survival rate in HCT116 cells (±s ,n=3)

3.2 芪珍膠囊對HCT116細胞凋亡的影響

如圖2所示，與對照組比較，芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細胞晚期凋亡率顯著升高（P＜0.01、0.001），芪珍膠囊（0.7 mg/mL）組細胞早期凋亡率顯著升高（P＜0.01）。

圖2 芪珍膠囊對HCT116細胞凋亡的影響 (±s ,n=3)Fig.2 Effect of Qizhen Capsule on apoptosis in HCT116 cells (±s ,n=3)

3.3 芪珍膠囊對HCT116細胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、PARP、mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表達的影響

如圖3、4所示，與對照組比較，芪珍膠囊（0.6、0.7 mg/mL）組細胞Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細胞cleaved Caspase-9、cleaved PARP和p-AMPK/AMPK蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），各劑量芪珍膠囊組細胞p-mTOR/mTOR、p-ERK/ERK和p-p38/p38蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。

圖3 芪珍膠囊對HCT116細胞Caspase-9、cleaved Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和PARP蛋白表達的影響 (±s ,n=3)Fig.3 Effect of Qizhen Capsule onexpressions of Caspase-9,cleaved Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2,and PARP in HCT116 cells(±s ,n=3)

3.4 芪珍膠囊對HCT116細胞PD-L1 mRNA表達的影響

如圖5所示，與模型組比較，芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細胞中PD-L1mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。

3.5 芪珍膠囊對結腸癌裸鼠移植瘤的影響

圖4 芪珍膠囊對HCT116細胞mTOR、p-mTOR、AMPK、p-AMPK、ERK、p-ERK、p38和p-p38蛋白表達的影響(±s ,n=3)Fig.4 Effect of QizhenCapsule on expressions of mTOR,p-mTOR,AMPK,p-AMPK,ERK,p-ERK,p38,and p-p38 in HCT116 cells (±s ,n=3)

圖5 芪珍膠囊對HCT116細胞PD-L1 mRNA表達的影響(±s ,n=3)Fig.5 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 mRNA level in HCT116 cells (±s ,n=3)

如圖6-A所示，對照組和氟尿嘧啶組裸鼠體質量均低于芪珍膠囊組，聯合用藥組裸鼠體質量高于模型組和氟尿嘧啶組，提示芪珍膠囊可減輕氟尿嘧啶的不良反應。如圖6-B、C所示，與對照組比較，芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯合用藥組裸鼠腫瘤體積顯著減?。≒＜0.05、0.01）。如圖6-D所示，與對照組比較，芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯合用藥組裸鼠瘤質量顯著降低（P＜0.05、0.01），表明芪珍膠囊能有效抑制裸鼠腫瘤生長，減輕氟尿嘧啶誘導的體質量減輕。

圖6 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型體質量 (A)、腫瘤體積 (B)、腫瘤終體積 (C) 和腫瘤質量 (D) 的影響 (±s ,n=12)Fig.6 Effect of Qizhen Capsule on bodyweight (A),tumor volume (B),average final tumor volume (C),and tumor weight (D)of nude mouse xenografts (±s ,n=12)

3.6 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

如圖7所示，與對照組比較，各給藥組裸鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯合用藥組裸鼠血清中IL-1β水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖7 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響 (±s ,n=3)Fig.7 Effect of Qizhen Capsule on levels of TNF-α,IL-6,and IL-1β in serum of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.7 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表達的影響

如圖8所示，與對照組比較，各給藥組裸鼠腫瘤組織中CD68mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），芪珍膠囊高劑量組、氟尿嘧啶組和聯合用藥組裸鼠腫瘤組織中NF-κB、TNF-α、IL-6和MCP-1mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），芪珍膠囊低劑量組、氟尿嘧啶組和聯合用藥組裸鼠腫瘤組織中iNOSmRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），芪珍膠囊高劑量組和聯合用藥組裸鼠腫瘤組織中PD-L1mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖8 芪珍膠囊對對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1、iNOS和PD-L1 mRNA表達的影響(±s ,n=3)Fig.8 Effect of Qizhen Capsule on mRNA levels of NF-κB,TNF-α,IL-6,CD68,MCP-1,iNOS,and PD-L1 in tumor of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.8 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1蛋白表達的影響

如圖9所示，與對照組比較，芪珍膠囊高劑量組和聯合用藥組裸鼠腫瘤組織中PD-L1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖9 芪珍膠囊對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1蛋白表達水平的影響 (±s ,n=3)Fig.9 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 expression in tumor of nude mouse xenografts model (±s ,n=3)

3.9 芪珍膠囊對IFN-γ誘導的HCT116細胞存活率的影響

如圖10所示，與對照組比較，模型組細胞存活率無明顯變化；與模型組比較，各給藥組細胞存活率顯著降低（P＜0.001）。

圖10 芪珍膠囊對IFN-γ誘導的HCT116細胞存活率的影響 ()Fig.10 Effect of Qizhen Capsule on survival rate in HCT116 cells induced by IFN-γ (±s ,n=3)

3.10 芪珍膠囊對IFN-γ誘導的HCT116細胞PD-L1蛋白表達的影響

IFN-γ是促進PD-L1表達最強的刺激因子[19]。如圖11所示，與對照組比較，模型組細胞PD-L1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，芪珍膠囊（0.5、0.6、0.7 mg/mL）組細胞PD-L1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001）。以上結果表明芪珍膠囊可以抑制PD-L1在異種移植瘤中的表達，也可以抑制IFN-γ誘導的HCT116細胞中PD-L1表達，提示芪珍膠囊可能在結腸癌中起到免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICPI）的作用。

圖11 芪珍膠囊對IFN-γ誘導HCT116細胞中PD-L1蛋白表達的影響 ()Fig.11 Effect of Qizhen Capsule on PD-L1 expression in HCT116 cells induced by IFN-γ (±s ,n=3)

4 討論

免疫治療，尤其是ICPI治療，對結腸癌有良好的療效[20-21]。抗PD-1藥物如pembrolizumab、nivolumab已被FDA批準并用于治療不匹配修復缺陷和微衛星不穩定性高型結腸癌患者[21]。由于患者復雜的分子遺傳特征，不同的結腸癌亞群對免疫治療有不同的反應[22]。然而，ICPI對呼吸系統、皮膚和胃腸道等器官均具有毒性作用[23]。因此，開發有效且安全的ICPI藥物對轉移性結腸癌的治療至關重要。中藥具有良好的抗癌作用，可降低ICPI誘導的免疫相關不良反應，是一種有前景的免疫治療藥物的輔助/替代品[23-24]。本研究發現，芪珍膠囊通過抑制HCT116細胞增殖、誘導細胞凋亡、調節信號轉導級聯并抑制IFN-γ誘導的PD-L1蛋白表達，從而抑制結腸癌細胞生長。芪珍膠囊能夠抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤生長，抑制炎性反應，緩解氟尿嘧啶引起的體質量下降，抑制免疫缺陷小鼠PD-L1表達，提示芪珍膠囊是一種有潛力的抗結腸癌ICPI藥物。

腫瘤的發生是一個復雜的過程，免疫系統作為機體的防御系統，可以通過適應性或獲得性免疫反應有效地識別外來物質并將其清除[25]。研究表明，免疫檢查點分子包括PD-1和PD-L1，均為結腸癌免疫治療的可能靶點[26]。PD-L1在結腸癌組織中高表達[26]。靶向阻斷腫瘤PD-1/PD-L1結合可增強抗腫瘤藥物的免疫應答，為腫瘤免疫治療提供機會。腫瘤PD-L1可調節腫瘤細胞的免疫非依賴性和內在功能，直接調節細胞凋亡和自噬[27]。本研究發現，芪珍膠囊顯著降低裸鼠移植瘤模型腫瘤組織PD-L1表達，降低腫瘤體積和腫瘤質量。在免疫缺陷小鼠和免疫功能小鼠中，卵巢癌、黑色素瘤和結腸癌細胞中PD-L1表達下調，癌細胞增殖和腫瘤形成被抑制[27-28]，與本研究結果一致，表明一種新的腫瘤細胞固有的PD-L1效應可能是非免疫介導的，也表明PD-L1作為一種潛在的抗癌生物標志物具有更廣泛的作用。本研究結果顯示，IFN-γ誘導的HCT116細胞中PD-L1蛋白表達水平升高[29]，芪珍膠囊顯著抑制IFN-γ誘導的HCT116細胞中PD-L1蛋白表達水平；而與模型組比較，氟尿嘧啶對裸鼠移植瘤模型腫瘤組織中PD-L1表達卻無明顯影響。有研究發現，氟尿嘧啶能夠誘導HCT116細胞PD-L1表達上調，可能是氟尿嘧啶誘導癌細胞耐藥或氟尿嘧啶誘導免疫耐藥所致[30]。綜上，芪珍膠囊可通過靶向PD-L1表達抑制結腸癌細胞增殖，可能是其發揮有效的免疫或非免疫介導的抗癌作用機制。

炎性反應可促進腫瘤的發生，在癌變過程中發揮重要作用[31]。20%～40%結腸癌患者存在系統性炎性反應[32]。結腸癌患者血清中IL-6和TNF-α水平升高，且IL-6和TNF-α的共同表達與患者預后差相關[33]。IL-1β和IL-6的表達均位于結腸癌上皮和基質中[34]。本研究結果顯示，芪珍膠囊可以顯著降低裸鼠移植瘤模型血清中IL-6、TNF-α和IL-1β水平。白藜蘆醇和三七能夠降低IL-6、TNF-α和IL-1β表達[35-36]。三七能夠抑制脂多糖誘導的小鼠DC2.4細胞中IL-6和TNF-α的分泌[37]。本研究發現，與模型組比較，芪珍膠囊顯著抑制裸鼠移植瘤模型腫瘤組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、CD68、MCP-1和iNOSmRNA表達水平，提示芪珍膠囊可能通過抑制炎性反應，抑制結腸癌發展。

持續存在的細胞增殖信號、規避生長抑制因子、促進侵襲和轉移、細胞永生化、誘導血管生成、抵御細胞凋亡是癌癥的特征，在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[38]。本研究發現，芪珍膠囊顯著抑制HCT116細胞增殖，呈劑量相關性，可能與誘導細胞凋亡有關。細胞凋亡是由多種基因調控的過程，PARP是細胞凋亡的標志，抗凋亡分子Bcl-2在結腸癌中高表達[39]。本研究結果顯示，芪珍膠囊下調HCT116細胞中Bcl-2蛋白表達水平，上調cleaved Caspases-9和cleaved PARP蛋白表達水平。研究發現，黃芪皂苷能夠上調HT-29細胞中cleaved PARP表達，下調Bcl-2和Caspase-3表達[40]。mTOR[41]、AMPK[42]和MAPK[43]等多種信號通路可以調節細胞增殖和凋亡。MAPK/ERK的激活能夠誘導細胞凋亡[44-45]。本研究發現，芪珍膠囊能夠激活HCT116細胞中mTOR、AMPK、ERK和p38信號通路，提示這些通路可能是芪珍膠囊在HCT116細胞中發揮抗癌作用的潛在下游信號級聯通路。

綜上所述，芪珍膠囊能夠通過誘導細胞凋亡、抑制炎癥及PD-L1表達等途徑抑制結腸癌的發生發展，可能是一種潛在的ICPI。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突