山豆根黃酮類成分對斑馬魚的急性毒性研究

袁文琳，黃崢蕊，肖思佳，張衛東*，沈云亨*

1.海軍軍醫大學（第二軍醫大學）藥學院，上海 200433

2.西安理工大學 應用化學系，陜西 西安 710048

山豆根又名廣豆根、越南槐根，是豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，臨床用于治療火毒蘊結、乳蛾喉痹、咽喉腫痛、齒齦腫痛、口舌生瘡等癥狀[1-2]。山豆根入藥的中藥制劑如桂林西瓜霜、清咽潤喉丸、清膈丸等均收錄于《中國藥典》，山豆根對肝炎、哮喘、慢性支氣管炎和咽喉腫痛具有較好的治療效果[1-4]。然而山豆根臨床不良反應報道時有發生[5-7]，《中國藥典》1985年版首次記載山豆根有毒，山豆根毒性反應涉及體內多個系統-器官，可引起肝臟損傷、神經毒性、心血管系統損害、胃腸道反應、皮膚過敏反應等[7-10]。山豆根含有生物堿類、黃酮類、三萜類、多糖、有機酸等多種化學成分，以生物堿和黃酮類成分為主，代表性成分包括苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因、山豆根酮等[11-15]。對于山豆根毒性物質基礎的研究，多集中于《中國藥典》含量測定限定的苦參堿和氧化苦參堿[16]，及其他含量較高的生物堿類成分[17-18]，對黃酮類等非生物堿類成分毒性研究較少。上海中醫藥大學安全評價中心研究發現，不同活性組分可能具有不同毒性，山豆根乙醇提取物對斑馬魚模型具有肝毒性，正丁醇、二氯甲烷部位有心血管毒性和肝毒性，且對小鼠的毒性研究中觀察到肝毒性[19]。課題組前期研究發現，山豆根70%乙醇提取物中含有大量黃酮類成分，能夠對SD大鼠產生明顯肝臟損傷。山豆根毒性成分不僅包括生物堿類，黃酮類成分也可能是毒性成分之一，目前對于山豆根黃酮類單體成分的毒性報道極少，進一步探究山豆根毒性成分對其安全合理用藥尤為重要。

本研究通過人心肌細胞AC16、人正常肝細胞L-02、人腎小管上皮細胞HK-2和人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y毒性實驗，對山豆根提取物、組分及主要單體成分逐步進行篩選，確定山豆根提取物主要的細胞毒組分，鑒定細胞毒組分中主要的化學成分，評價細胞毒組分中主要成分的細胞毒性；再進一步利用斑馬魚急性毒性模型，對鑒定的細胞毒成分進行急性毒性評價。

1 材料

1.1 細胞

AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞購自美國ATCC。

1.2 動物

野生AB品系斑馬魚購自杭州環特生物科技股份有限公司，動物許可證號SYXK（浙）2012-0171。斑馬魚用（28±0.5）℃養魚用水（每升反滲透水含200 mg速溶海鹽、50～100 mg/L CaCO3、pH 6.5～8.5、電導率450～550 μs/cm），于（28±2）℃生化培養箱中培養。使用受精后2 d（2 dpf）的斑馬魚進行實驗，動物實驗經動物實驗管理委員會批準（批準號001458）。

1.3 藥材

山豆根（批號20190305，產地為廣西靖西縣）購自廣西宏锃藥業有限公司，經海軍軍醫大學藥學院沈云亨副教授鑒定為豆科植物越南槐S.tonkinensisGagnep.的干燥根，山豆根中苦參堿和氧化苦參堿總質量分數為1.82%，符合《中國藥典》2020年版規定[1]。藥材標本（20190305-SDG）保存于海軍軍醫大學藥學院天然藥物化學教研室。

1.4 藥品與試劑

對照品苦參堿（批號drk-0448-930730）、氧化苦參堿（批號drk-0453-930327）、馬卡因（批號drk-0341-940422）購自成都德銳可生物科技有限公司，質量分數均為98%；山豆根酮對照品（批號S0304AS，質量分數為98%）購自大連美倫生物技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號USP6F1S）購自德國WAK-Chemie Medical GmbH公司；甲基纖維素（批號079K0054V）美國Sigma公司；分析純無水乙醇、甲醇購自上海潤捷化學試劑有限公司；DMEM培養基（批號C11995500CP）、PBS緩沖液（批號10010-023）、RPMI 1640（批號C11995500BT）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號10099-141）購自美國Hyclone公司；牛血清白蛋白（批號wxbc6759v）、0.05%胰酶-EDTA（批號25300-054）購自美國Life Technologies公司；Cell Titer Glo試劑（批號0000350448）購自美國Promega公司；4%多聚甲醛購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；二甲苯購自上海麥克林生化科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液購自上海依赫生物科技有限公司。

1.5 儀器

96孔細胞培養板、細胞培養皿、75 cm2細胞培養瓶（美國Coning公司）；6孔板（無錫耐思生命科技股份有限公司）；CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LDZX型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；多功能檢測儀（美國Bio Tek公司）；HFsafe-1200LC型生物安全柜（上海力新儀器有限公司）；Boxun超凈工作臺、SPX-250B-Z型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；SZX7型解剖顯微鏡（日本Olympus公司）；CCD相機（上海土森視覺科技有限公司）；CP214型精密電子天平（中國OHAUS公司）。

2 方法

2.1 山豆根提取物的制備

2.1.1 山豆根水提物（SDG-SJ）的制備 取1 kg干燥粉碎的山豆根藥材，加入6倍量水，浸泡30 min，加熱煮沸后，煎煮1 h，濾過；藥渣加入6倍量水，重復煎煮1次，濾過，合并2次濾液，真空減壓濃縮得到0.47 kg浸膏，于低溫真空干燥箱干燥得到0.16 kg干浸膏，粉碎后得到0.15 kg SDG-SJ。

2.1.2 山豆根醇提物（SDG-Et）的制備 取1 kg干燥粉碎的山豆根藥材，加入70%乙醇，浸泡30 min，加熱回流提取1 h，提取2次，合并2次提取液，真空減壓濃縮后，于真空低溫干燥箱干燥得到浸膏，粉碎后得到0.14 kg SDG-Et。

2.1.3 SDG-Et洗脫組分的制備 取100 g SDG-Et，以70%乙醇溶解，分批加入400 g MCI凝膠樹脂中拌樣，揮干溶劑后，裝入上樣柱。取2 kg MCI凝膠樹脂，甲醇浸泡1 h，攪拌均勻，加入 460 mm×70 mm中壓柱，待MCI樹脂沉降均勻后，以超純水替換樹脂中的甲醇溶劑，和上樣柱連接，以Buchi中壓液相色譜儀進行中壓柱色譜，分別以10倍柱體積水、40%甲醇、70%甲醇、100%甲醇進行柱色譜，分別收集各部位洗脫液，以旋轉蒸發儀真空濃縮干燥，分別得到82.88 g水洗脫組分（SDG-SX）、30.83 g 40%甲醇洗脫組分（SDG-40X）、14.24 g 70%甲醇洗脫組分（SDG-70X）和12.44 g甲醇洗脫組分（SDG-100X）。

2.2 山豆根提取物對AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞存活率的影響

細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，分別取處于對數生長期的AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞，以2×103/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。分別精密稱取SDG-SJ和SDG-Et，以DMSO溶解配制成質量濃度為100 μg/mL的溶液，分別精密稱取SDG-SX、SDG-40X、SDG-70X和SDG-100X，以DMSO溶解配制成質量濃度為50 μg/mL的溶液。設置對照組、SDG-SJ組、SDG-Et組、SDG-SX組、SDG-40X組、SDG-70X組和SDG-100X組，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養72 h，加入100 μL Cell Titer Glo試劑，37 ℃避光振蕩10 min，采用多功能檢測儀于490 nm檢測吸光度（A）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝A給藥/A對照

2.3 SDG-100X主要化學成分的鑒定

精密稱取馬卡因2.84 mg和山豆根酮4.60 mg，加入1 mL DMSO超聲溶解，混勻，配制成混合對照品溶液。采用高效液相色譜（HPLC）對SDG-100X的主要化學成分進行表征[20]。

2.4 苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮對AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞活力的影響

分別精密稱取苦參堿2.48 mg、氧化苦參堿2.64 mg、馬卡因2.84 mg、山豆根酮4.60 mg，加入1 mL DMSO超聲溶解，搖勻，配制成10 mmol/L儲備液，于 ?20 ℃保存，使用前以DMEM稀釋。按“2.2”項下方法處理細胞，檢測A值，計算細胞存活率。

2.5 山豆根酮對斑馬魚的急性毒性評價

2.5.1 最大非致死濃度（maximun non-lethal concentration，MNLC）、10%致死濃度（10% lethal concentration，LC10）和半數致死濃度（half lethal concentration，LC50）的測定 隨機選取240尾2 dpf斑馬魚于6孔板中，設置對照組、溶媒組和山豆根酮（2.32、6.95、20.85、33.25、108.55、217.10 μmol/L）組，每組30尾。精密稱取山豆根酮4.60 mg，加入1 mL DMSO超聲使溶解，搖勻，配制成10 mmol/L儲備液，于 ?20 ℃保存，使用時以標準稀釋水（含1% DMSO）稀釋。各給藥組加入3 mL相應藥物，對照組加入標準稀釋水，溶媒組加入1% DMSO溶液，于（28±2）℃生化培養箱中培養72 h。每天統計并及時移除死亡斑馬魚，記錄各組斑馬魚死亡數量和毒性情況，采用GraphPad Prism 8.0.1軟件繪制斑馬魚“濃度-死亡率”效應曲線，計算山豆根酮對斑馬魚的MNLC、LC10和LC50。

2.5.2 急性毒性實驗 隨機選取180尾2 dpf斑馬魚于6孔板中，設置對照組、溶媒組和山豆根酮（1/9 MNLC、1/3 MNLC、LC10、LC50）組，每組30尾。各給藥組加入3 mL相應藥物，對照組加入標準稀釋水，溶媒組加入1% DMSO溶液，于（28±2）℃生化培養箱中培養72 h。每天于顯微鏡下觀察并記錄斑馬魚毒性發生情況，移除死亡斑馬魚。給藥結束后，于顯微鏡下拍照并記錄斑馬魚器官與組織情況，計算心臟、腦部、眼、肝臟、腎臟、軀干/尾/脊索、運動能力等毒性發生率。

2.5.3 斑馬魚肝臟組織病理變化 給藥結束后，斑馬魚麻醉，用4%多聚甲醛處死，固定過夜，進行脫水、石蠟包埋、切片，采用HE染色，于顯微鏡下觀察斑馬魚肝臟組織病理變化。

2.6 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.1和SPSS 22.0軟件進行統計學分析，兩組比較采用非配對t檢驗或單因素方差分析。

3 結果

3.1 山豆根提取物對AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組比較，各給藥組AC16、HK-2細胞存活率均顯著降低（P＜0.001），SDG-SJ、SDG-40X、SDG-70X和SDG-100X組SH-SY5Y細胞存活率顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），SDG-SJ和SDG-40X組L-02細胞存活率顯著升高（P＜0.001），SDG-SX和SDG-100X組L-02細胞存活率顯著降低（P＜0.05、0.001），表明SDG-100X對細胞的毒性最強。

圖1 山豆根提取物對AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞存活率的影響 (±s ,n=3)Fig.1 Effect of extracts of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma on survival rate on AC16,L-02,HK-2,and SH-SY5Y cells(±s ,n=3)

3.2 SDG-100X主要化學成分鑒定

如圖2所示，SDG-Et無生物堿成分，馬卡因和山豆根酮2個黃酮類成分質量分數最高，分別為5.46%、8.03%，是山豆根主要的黃酮類成分。苦參堿和氧化苦參堿為山豆根藥材藥典規定的質量控制成分，且為潛在的毒性成分。因此，選擇苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮4個成分作為山豆根代表性成分進行細胞毒性篩選。

圖2 SDG-100X (A) 和混合對照品溶液 (B) 的HPLC圖Fig.2 HPLC of SDG-100X (A) and mixed standards solution (B)

3.3 苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮對AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞活力的影響

如圖3所示，苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮抑制AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞活力，呈劑量相關性，山豆根酮對4種細胞毒性均較強，因此后續選擇山豆根酮進行斑馬魚急性毒性研究。

圖3 苦參堿、氧化苦參堿、馬卡因和山豆根酮對AC16 (A)、L-02 (B)、HK-2 (B) 和SH-SY5Y (D) 細胞活力的影響(±s ,n=3)Fig.3 Effect of matrine,oxymatrine,maackiain,and sophoranone on cell viability of AC16 (A),L-02 (B),HK-2 (C),and SH-SY5Y (D) cells (±s ,n=3)

3.4 山豆根酮對斑馬魚的MNLC、LC10和LC50

如表1所示，給予山豆根酮（2.32、6.95 μmol/L）72 h，無斑馬魚死亡；給予山豆根酮（20.85、33.25、108.55、217.10 μmol/L）72 h，分別有12、27、30、30尾斑馬魚死亡。采用GraphPad Prism 8.0.1軟件擬合，如圖4所示，山豆根酮對斑馬魚的MNLC、LC10和LC50分別為11.59、15.57、22.45 μmol/L。

表1 山豆根酮對斑馬魚的死亡率Table 1 Mortality rate of sophoranone on zebrafish

圖4 山豆根酮對斑馬魚的“濃度-死亡率”曲線Fig.4 “Concentration-mortality rate” curve of sophoranone on zebrafish

3.5 山豆根酮對斑馬魚的急性毒性

如表2和圖5所示，對照組和溶媒組斑馬魚卵黃囊基本吸收完全，各臟器均未出現明顯毒性表型，運動無明顯異常；山豆根酮（1/9 MNLC、1/3 MNLC、LC10）組斑馬魚均未出現死亡，山豆根酮（LC50）組2尾斑馬魚死亡；各劑量山豆根酮組均表現出肝毒性；山豆根酮（1/9 MNLC）組4尾斑馬魚卵黃囊吸收延遲；山豆根酮（1/3 MNLC）組3尾斑馬魚肝臟腫大，6尾斑馬魚卵黃囊吸收延遲；山豆根酮（LC10）組10尾斑馬魚肝臟腫大，1尾斑馬魚肝變性，17尾斑馬魚卵黃囊吸收；山豆根酮（LC50）組15尾斑馬魚肝臟腫大，2尾斑馬魚肝變性，28尾斑馬魚卵黃囊吸收延遲；山豆根酮（LC10、LC50）組均出現心臟毒性，山豆根酮（LC10）組4尾斑馬魚心跳減慢，山豆根酮（LC50）組8尾斑馬魚心包水腫、27尾斑馬魚心跳減慢；山豆根酮（LC10、LC50）組斑馬魚軀干彎曲，可見運動頻率加快、運動軌跡異常等行為異常，表現出神經毒性。

表2 山豆根酮對斑馬魚的急性毒性發生率Table 2 Acute toxicity rate of sophoranone on zebrafish

圖5 山豆根酮對斑馬魚的毒性典型表型圖Fig.5 Typical toxicity phenotype of sophoranone on zebrafish

綜上，山豆根酮致斑馬魚神經毒性表型中行為異常出現濃度為11.59 μmol/L；肝臟毒性表型中卵黃囊吸收延遲出現濃度為1.29 μmol/L，肝腫大出現濃度為3.86 μmol/L；心血管毒性表型中心跳減慢、血流減慢和循環缺失均為11.59 μmol/L，心包水腫為15.57 μmol/L；腎臟水腫表型出現濃度為15.57 μmol/L；腸道發育異常出現濃度均為1.29 μmol/L。除上述毒性表型外，各劑量山豆根酮組對斑馬魚其他組織器官均未觀察到毒性反應。以上數據表明山豆根酮可能具有潛在肝毒性、心臟毒性、腎毒性、神經毒性和其他毒性。

3.6 山豆根酮對斑馬魚的肝臟毒性

如圖6所示，對照組斑馬魚肝臟細胞輪廓清晰，未見肝臟腫大和空泡，細胞質分布均勻，細胞核大小形態規則、相互交錯；與對照組相比，山豆根酮（LC50）組肝臟細胞腫大，可見明顯脂肪樣空泡，但無明顯炎性浸潤，表明山豆根酮（LC50）可誘發斑馬魚肝毒性。

圖6 山豆根酮對斑馬魚肝臟病理變化的影響 (HE,×200)Fig.6 Effect of sophoranone on liver histological change in zebrafish (HE,× 200)

4 討論

山豆根為常用有毒中藥材，其生物堿類成分如苦參堿和氧化苦參堿是山豆根的有效成分和潛在的毒性成分。然而，近年來研究表明山豆根的非生物堿類成分，尤其是黃酮類成分，有可能也是其潛在的毒性成分之一。山豆根中含有大量的黃酮類成分，尤其黃酮類的代表性成分如馬卡因、山豆根酮在山豆根中含量較高，因此篩選并評價黃酮類成分的毒性尤為重要。目前對于藥物毒性評價研究，主要有以細胞為代表的體外模型和以哺乳動物為代表的體內評價模型。體外細胞模型用于毒性成分快速、高效的初步篩選，已被廣泛認可，但由于毒性作用的復雜性，體外篩選的結果需要進一步的體內毒性研究驗證。斑馬魚作為一種新型模式動物，其與人類87%的基因組序列高度相似[21]，相比哺乳動物，斑馬魚具有體透明易觀察、用藥少、易操作、周期短等特有優勢，逐漸被廣泛應用[22-23]。近年來模式生物斑馬魚對藥物在體內肝毒性[22,24]、腎毒性[25]、神經毒性[26-27]、心臟毒性[27-28]等早期毒理學評價中應用較廣，因其具備細胞模型高通量篩選的優勢，且兼顧體內動物模型近似人的整體生物反應特點，日益被認可[29-30]。基于斑馬魚模型的中藥毒性研究有助于快速得到宏觀毒性靶器官、靶組織，便捷地闡明毒性機制[23-24,30-32]。

為追蹤鑒定山豆根潛在的毒性成分，本研究從提取物-組分入手，進行體外細胞毒性模型初步篩選，發現SDG-SJ和SDG-Et均可提高L-02細胞存活率，表明SDG-SJ和SDG-Et具有一定的肝保護作用；SDG-Et對AC16、HK-2和SH-SY5Y細胞存活率的抑制作用比SDG-SJ強。前期研究發現，70%乙醇對山豆根藥材中的化學成分提取較完全，包括水溶性大極性成分和脂溶性小極性成分，而水煎煮提取物中的化學成分主要為水溶性大極性成分，脂溶性小極性成分較少。結合本研究結果，推測山豆根中的毒性成分可能為脂溶性小極性成分，表明了傳統中藥采用水煎的合理性。SDG-Et的4個組分對AC16、L-02、HK-2和SH-SY5Y細胞毒性實驗中，SDG-100X對L-02細胞存活率的抑制作用大于SDG-SX，SDG-40X和SDG-70X可提高L-02細胞存活率，表明SDG-40X和SDG-70X具有一定的肝保護作用，且前期研究發現山豆根生物堿類成分主要集中于SDG-40X，與文獻報道中的山豆根藥材生物堿類為治療肝炎的主要活性成分相符[33-34]。各組分對AC16、HK-2和SH-SY5Y細胞存活率均具有一定的抑制作用，表明山豆根生物堿部位和非生物堿部位均可能是潛在的毒性部位，其中SDG-100X對4種細胞存活率的抑制作用最強，推測其可能為主要的毒性部位，表明山豆根中的脂溶性小極性成分可能是山豆根潛在的毒性成分。分析SDG-100X的化學成分，發現黃酮類成分馬卡因和山豆根酮是其含量最高的成分。

苦參堿和氧化苦參堿是山豆根的主要有效成分，也是山豆根可能的毒性成分。本研究選擇SDG-100X中的主要成分馬卡因、山豆根酮以及山豆根主要生物堿類成分苦參堿、氧化苦參堿，考察其細胞毒性，結果顯示，山豆根酮對HK-2細胞活力的抑制作用與苦參堿、氧化苦參堿相近，對AC16、L-02和SH-SY5Y細胞活力的抑制作用強于苦參堿和氧化苦參堿，表明山豆根酮也可能是山豆根的潛在毒性成分。基于山豆根4個主要成分的細胞毒性篩選結果，選擇山豆根酮展開斑馬魚體內急性毒性研究，發現山豆根酮組斑馬魚毒性表型明顯，主要表現為神經毒性（行為異常、軀干彎曲）、肝臟毒性（卵黃囊吸收延遲、肝臟細胞腫大及脂肪樣空泡、肝腫大）、心血管毒性（心包水腫、心跳減慢、血流減慢、循環缺失）、腎臟毒性（腎臟水腫）和腸道發育異常。

綜上所述，本研究結合山豆根提取物-組分-單體成分的體外細胞模型毒性篩選結果，利用斑馬魚模型對山豆根黃酮類成分山豆根酮的急性毒性進行評價，發現山豆根酮能夠誘導斑馬魚肝毒性的發生，并伴有神經毒性、心血管毒性等表現，為山豆根毒性物質基礎的進一步明確提供了數據支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突