基于網絡藥理學和分子對接探究經典名方桃紅四物湯異病同治作用機制

鄧晶晶，江華娟，蘭 興，李敏敏，王升菊，何 瑤

成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室，四川 成都 611137

桃紅四物湯是古代經典名方目錄（第1批）中收載的百首經典名方之一，也是國家最早發布古代經典名方關鍵信息的7首方劑之一。該方出自清代柴得華《婦科冰鑒》，處方組成為生地（3錢，酒洗）、當歸（4錢，酒洗）、白芍錢（5分，酒炒）、川芎（1錢）、桃仁（14粒，去皮尖研泥）、紅花（1錢，酒洗），功效為“養血、活血、逐瘀”[1]。該方最早見于清代吳謙所著《醫宗金鑒?婦科心法要決》，是在婦科圣方四物湯（補血活血）的基礎上，加桃仁-紅花藥對增強活血化瘀之功，對血瘀而兼有血虛者尤為適宜，適用于血瘀引起的多種病癥[2-3]。按照《醫林改錯》記載，根據病變部位不同，“血瘀”可分為頭部、胸部、腹部、少腹部、肢體經絡5個方面，其代表疾病依次為腦梗死[4-5]、冠心病和心絞痛[6-9]、高血壓[10]、肝硬化[11]、月經失調[12]、類風濕性關節炎[13]等，桃紅四物湯均可治之。

桃紅四物湯已成為中醫臨床使用最廣泛的活血化瘀方劑之一，也是異病同治的典型方劑。課題組前期對該方劑的化學成分、藥理作用及臨床應用進行文獻挖掘[14]，發現其較多臨床應用的治療作用機制研究還不深入、缺乏實驗研究基礎。中藥復方化學成分復雜，臨床療效的表現是其多成分、多靶點、多途徑的協同作用，桃紅四物湯以其養血和活血化瘀功效為核心應用于多種疾病的治療，其成分-靶點-通路-疾病之間的交互作用網絡如何關聯，是該方劑現代應用中亟待探究的關鍵問題。

隨著組學技術的發展完善，系統生物學及多向藥理學已廣泛應用于多種疾病及藥理、毒理等方面研究。網絡藥理學（network pharmacology）融合了系統生物學和多向藥理學的思想，通過構建“成分-靶點-通路-疾病”之間的復雜網絡分析藥物有效成分的作用機制，使藥理研究由尋找單一靶點的傳統研究理念轉向了網絡綜合分析思維，已經開始逐步滲透到中醫藥領域的各個方面，系統科學地解析中藥或中藥復方。網絡藥理研究中，同一疾病在不同發展階段，可由不同的蛋白（或基因）調控；部分蛋白亦可在多種疾病中起中樞調控作用，與“同病異治”和“異病同治”的中醫藥理論不謀而合。本研究采用網絡藥理學的方法，以桃紅四物湯活血化瘀功效為核心，系統綜合地探尋桃紅四物湯對疾病網絡的干預與影響，探索其多成分與多靶點、多疾病之間的復雜關系，從系統生物學整體水平揭示其潛在有效成分和藥理作用機制，為其基礎研究和臨床應用奠定理論基礎。

1 方法

1.1 研究思路

本研究基于網絡藥理學的桃紅四物湯主要成分與作用機制關聯分析研究思路見圖1。

圖1 桃紅四物湯網絡藥理學研究思路Fig.1 Schematic diagram of network pharmacology research of Taohong Siwu Decoction

1.2 桃紅四物湯有效成分篩選

以桃紅四物湯中生地黃、當歸、川芎、白芍、桃仁和紅花6味藥材為關鍵詞，在中藥系統藥理數據庫及分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中篩選出桃紅四物湯現有成分的數據；以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，小腸滲透率（Caco-2）≥0.4為標準。同時，結合課題組前期研究結果及文獻檢索對有效活性成分進行完善。

1.3 桃紅四物湯化學成分潛在靶點預測、蛋白-蛋白相互作用網絡構建與分析及疾病預測

將篩選得到的有效成分在TCMSP中預測相關靶點，將獲得的桃紅四物湯潛在靶點數據導入STRING 11.0軟件（http://string-db.org），并將物種限定為“homo snpiens”。選取置信度高于0.9的數據，構建桃紅四物湯的蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，根據網絡中基因與鄰接基因的數目，找出網絡的核心基因。將篩選得到桃紅四物湯潛在作用靶點作為關鍵詞，在TCMSP中匹配靶點所對應的疾病。

1.4 網絡構建與分析

將“藥材-成分”“成分-靶點”“靶點-疾病”文件輸入Cytoscape 3.7.2構建桃紅四物湯“藥材-成分-靶點”“疾病-靶點”網絡圖。在網絡中，藥材、成分、靶點、疾病是由節點來表示，兩個節點之間的相互作用由邊來表示。

1.5 基因本體論（gene ontology，GO）和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對核心靶點及PPI核心基因進行GO生物學過程富集分析；使用KEGG（http://www.kegg.jp/）對靶點進行通路注釋，篩選P≤0.05的顯著途徑進行聚類分析。

1.6 分子對接驗證

使用AutoDock軟件（4.2版）進行分子對接，該軟件采用Lamarckian遺傳算法驗證復合靶的關聯性。在Autodock工具中準備蛋白質和配體，目標蛋白的三維結構從RCSB-PDB數據庫（http://www.pdb.org）下載。對接數據庫進行再對接，加入氫原子，通過Auto工具計算對接結合能，探討成分與靶點之間的結合作用。通過程序Pymol繪制靶點蛋白和分子的對接圖。

2 結果

2.1 活性成分篩選

通過篩選，確定了桃紅四物湯中的25個潛在化合物（OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2≥0.4）。同時，據文獻查閱，納入了15個活性化合物進行研究。共從桃紅四物湯中篩選出40個活性化合物，其中9個來自桃仁、16個來自紅花、5個來自當歸、10個來自川芎、8個來自白芍、5個來自地黃。其中川芎、當歸共有成分3個，桃仁、紅花、當歸、白芍共有成分1個，紅花、白芍共有成分1個，紅花、桃仁共有成分2個；川芎、白芍、生地黃共有成分1個，紅花、當歸、生地黃共有成分1個。篩選出的40個成分見表1。

2.2 桃紅四物湯作用靶點預測及PPI網絡構建

本研究利用TCMSP靶點預測技術對上述活性成分進行作用靶點預測，排除重復靶點，共獲得32個化合物對應的預測靶點221個。將靶點蛋白對應的基因輸入String數據庫獲取PPI網絡，網絡中含有220個節點，798條相互作用關系。利用String繪制得分前30個PPI蛋白的互作網絡圖，見圖2。利用Cytoscape 3.7.2的Cytohubba插件中的degree算法篩選出得分前30的蛋白作為Hub蛋白，見圖3。其中關鍵靶點包括：RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine protein kinase，AKT1，degree＝132）、血清白蛋白（albumin，ALB，degree＝122）、白細胞介素-6（intedeukin-6，IL-6，degree＝120）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA，degree＝112）、AP-1轉錄激活因子（transcription factor AP-1，JUN，degree＝106）等。

2.3 構建“疾病-靶點”網絡

將221個相關靶點蛋白在TCMSP數據庫中進行匹配，其中92個靶點蛋白可匹配286種疾病，129個靶點蛋白未能匹配到相關疾病。根據靶點蛋白與疾病的關系可以構建“疾病-靶點”網絡，涉及92個靶點，286個疾病，為了能夠更加直觀地探析桃紅四物湯治療疾病的作用機制，本研究對286種疾病的degree值進行計算，分析得到的關鍵疾病主要為癌癥相關疾病（乳腺癌D43、前列腺癌D33等）、心血管相關疾病（高血壓D10、心肌梗死D47、心臟衰竭D11）、神經系統相關疾病（阿爾茨海默病D3），見圖4。從中篩選代表性疾病（乳腺癌、高血壓），根據桃紅四物湯成分、靶點蛋白與疾病的關系構建“成分-靶點-疾病”網絡，見圖5。

表1 從桃紅四物湯中篩選出的40個活性成分及其參數Table 1 Forty active ingredients and their parameters in Taohong Siwu Decoction

2.4 桃紅四物湯作用靶點預測及“藥材-成分-靶點”網絡構建

利用Cytoscape 3.7.2將篩選得到的有效成分和預測得到的相關靶點，進行關系網絡繪制和分析，桃紅四物湯發揮重要作用的有效成分與對應的作用靶點的相互關系共546個，見圖6。

圖2 桃紅四物湯相關靶點的PPI網絡 (前30)Fig.2 PPI network of Taohong Siwu Decoction related targets (top 30)

圖3 桃紅四物湯關聯的核心靶點柱狀圖 (前30)Fig.3 Histogram of core targets associated with Taohong Siwu Decoction (top 30)

2.5 GO和KEGG通路富集分析結果

圖4 “疾病-靶點”網絡Fig.4 “Disease-target” network

圖5 “成分-靶點-疾病”網絡Fig.5 “Component-target-disease” network

圖6 桃紅四物湯“藥材-成分-靶點”網絡Fig.6 “Medicinal material-component-target” network of Taohong Siwu Decoction

將221個基因輸入DAVID Bioinformatics Resources 6.8，得到646條GO條目與生物學過程有關，參與促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤增生、免疫調節、內分泌調節、血液循環系統調節等多種生物學過程。根據P≤0.05篩選出169個GO條目，在GO富集分析中，其中前30個差異基因的結果見圖7。將獲得的靶點導入KEGG數據庫，在通路水平上全面揭示桃紅四物湯的作用機制。最終得到了165條關鍵通路，根據P≤0.05篩選出前30條富集通路，見圖8。通路上的所含基因產物（靶點）越多，桃紅四物湯越有可能通過這些通路發揮作用，包括IL-17信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等。這165條關鍵通路的生物學功能可以分為4個主要調節模塊：促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤增生、免疫調節、內分泌調節、血液循環系統調節。從主要的4個模塊中篩選出關鍵通路的代表，分別為TNF通路、IL-17通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路（圖9）。結果表明，AKT1、細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、IκB激酶β（inhibitor of NF-κB kinase β，IKKβ）等核心靶點在通路網絡中起著關鍵作用。

圖7 GO通路富集分析結果Fig.7 Analysis results of GO pathway enrichment

圖8 KEGG通路富集分析結果Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis results

圖9 桃紅四物湯關鍵通路圖Fig.9 Key pathway diagram of Taohong Siwu Decoction

2.6 桃紅四物湯活性成分和核心靶點分子對接驗證

將桃紅四物湯篩選得到的核心靶點與其所對應的關鍵蛋白使用AutoDock軟件進行分子對接驗證，以直觀的方式展示了關鍵成分的最佳構型和核心靶點之間的相互作用，對接結果如表2所示，分子與標靶蛋白的最低結合能均小于0，說明配體與受體均可以自發結合，其中AKT1蛋白與咖啡酸、阿魏酸、山柰酚的對接結合能均小于?5 kJ/mol，結合能分別為?5.09、?6.17、?6.24 kJ/mol；IL-6蛋白與山柰酚結合能為?5.68 kJ/mol。主要活性成分和核心靶點之間的結合情況與預測關系相符。如圖10-A所示，咖啡酸與AKT1的ARG-15和LYS-20殘基的氫鍵連接；如圖10-F所示，阿魏酸與IL-6的LYS41殘基的氫鍵相對接；如圖10-I所示，槲皮素與VEGFA的LYS-48殘基的氫鍵對接。桃紅四物湯中的主要活性成分與核心靶點的高結合親和力表明，桃紅四物湯可能是通過調節以上相關靶標發揮治療作用。

表2 桃紅四物湯核心有效成分分子對接結果Table 2 Molecular docking results of core active ingredients of Taohong Siwu Decoction

3 結論與討論

桃紅四物湯在四物湯的基礎上加用桃仁、紅花2味藥，增強了活血化瘀的功效，具有補血而不滯血、和血而不傷血的特點，臨床用于血瘀證引起的諸多疾病。瘀血學說始見于《黃帝內經》，奠基于張仲景，瘀血既成后，又可作為病因影響人體氣血和臟腑功能，引起疼痛、出血、經脈瘀塞不通、臟腑癥結，以及“瘀血不去，新血不生”等諸多病理變化，為桃紅四物湯在臨床上異病同治奠定了理論基礎。本研究通過成分、靶點匹配和分子對接，發現桃紅四物湯中活性成分阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚、咖啡酸、芍藥苷、藁本內酯能匹配到較多靶點，關鍵靶點分別與腫瘤細胞增殖與凋亡、免疫調節、內分泌調節、血液系統調節相關，主要涉及TNF、IL-17、MAPK、VEGF信號通路，預測得到桃紅四物湯治療的主要疾病主要為癌癥相關疾病、心血管相關疾病、神經系統相關疾病。

阿魏酸、山柰酚、槲皮素、丹皮酚、芍藥苷、藁本內酯、咖啡酸能匹配到較多靶點，且常用于桃紅四物湯的質量控制，阿魏酸、山柰酚、芍藥苷分別為《中國藥典》2015年版規定的當歸和川芎、紅花、白芍的含量測定指標。研究表明，阿魏酸是當歸、川芎的共有成分，具有抗血栓、調脂、抗氧化、抗菌、抗炎作用[15]；山柰酚為紅花、白芍的共有成分，能抗癌、抗氧化、抗炎、抗骨質疏松等[16-17]；槲皮素為紅花、桃仁的共有成分，可抑制各種腫瘤細胞的增殖，與凋亡調節因子Bax和Bcl-2有關，能上調半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic acid protease，Caspase），下調NF-κB表達；芍藥苷為白芍的主要有效成分，具有解痙鎮痛、解熱、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[18-19]；藁本內酯為川芎和當歸的共有活性成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化以及神經保護作用[20]；咖啡酸是川芎、當歸中的活性成分，具有抗腫瘤作用，其作用機制與抑制Akt有關[21]。由此可見，這些成分可以作為桃紅四物湯重要的有效成分，并用于該方劑的質量控制。

圖10 分子對接模式圖Fig.10 Molecular docking diagram

基于活性化合物篩選得到的關鍵靶點可分為4類，分別與腫瘤細胞增殖與凋亡、免疫調節、內分泌調節、血液系統調節相關。抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡相關靶點蛋白為AKT1、ALB、JUN、myc原癌基因蛋白質（myc proto-oncogene protein，MYC）、Caspase-3蛋白酶（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等；免疫調節相關靶點為IL-6、IL-1β、IL-10等；內分泌調節相關靶點為ESR1、前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、受體酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）、雄激素受體（androgen receptor，AR）等；血液系統調節相關靶點為VEGFA、HIF-1A、表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、前表皮生長因子（pro-epidermal growth factor，EGF）、內皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,endothelial，NOS3）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等。桃紅四物湯臨床上治療疾病多與這4個方面相關，其治療原發性痛經[22]、月經不調[23]、子宮肌瘤[24]、多囊卵巢綜合癥[25]、子宮出血[26]等婦科疾病，可能均與內分泌調節有關；治療冠心病、高血壓[27]、腦梗死[28]、腦出血[29]等疾病則與血液系統的靶點相關；治療類風濕性關節炎[30]、腎小球腎炎[31]等疾病可能與免疫調節相關；治療乳腺癌[32]可能與腫瘤細胞增殖與凋亡的靶點相關。

從主要的4個模塊中篩選出關鍵通路，分別為TNF信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、VEGF信號通路。（1）TNF信號通路調節著很多重要的生物學活動，如免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡和腫瘤發生。研究發現TNF-α與其配體TNFR的相互作用參與了許多人類疾病的發生，如敗血癥、糖尿病、癌癥、骨質疏松癥和類風濕性關節炎等[33]。桃紅四物湯有效成分可抑制TNF的表達，阻斷TNF信號通路起到抗腫瘤的作用[34]。（2）IL-17是一個重要的促炎癥細胞因子，其信號通路與免疫調節相關，在多種炎性反應及自身免疫性疾病病理過程中發揮關鍵作用[35]。大量臨床研究也發現，桃紅四物湯在治療腰椎間盤突出[36]、改善全髖關節置換術后凝血功能及疼痛程度[37]等疾病時，可降低患者血清中炎癥介質IL-17水平，其可作用于這些靶點提高免疫系統功能。（3）MAPK信號通路與炎癥和腫瘤相關，該通路參與了細胞生長、發育、增殖、分化等多種生理、病理過程[38]。研究也發現，桃紅四物湯通過調節MAPK信號通路抑制血管平滑肌的遷移和增殖[39]，聯合化學藥治療哮喘[40]等。（4）VEGF是調節血管生成和血管新生的重要調節因子。分泌VEGF對于維持血管平衡穩定和存活起著十分重要的作用。生理狀態下，血管生成過程被嚴格調控，只有在特殊情況下被激活，如傷口愈合過程；病理狀態下，如癌癥發生發展過程中，往往伴隨著過度的血管生成，以提供更多營養供癌細胞生長。因此，現代治療腫瘤的方法中，很重要的一個策略就是抑制腫瘤中血管生成[41]。研究發現，桃紅四物湯活血化瘀治療痛經、乳腺癌等疾病與VEGF信號通路有著密切的聯系[42-44]。

將匹配的關鍵靶點進行疾病關聯，得到桃紅四物湯治療的主要疾病主要為癌癥相關疾病、心血管相關疾病、神經系統相關疾病。（1）其中癌癥相關疾病包括乳腺癌、前列腺癌等。乳腺癌屬于中醫“乳巖”范疇，瘀血內結是乳巖發生、發展的重要病機之一。中醫認為血瘀與腫瘤互為因果，且貫穿腫瘤進展的始終；現代臨床研究表明，中醫辨證為瘀毒內阻型的乳腺癌術后患者45%發生血行轉移[45]，大多數乳腺癌患者體內普遍存在著血液高凝狀態。桃紅四物湯能抑制乳腺癌患者腫瘤血管生成[46]，提高化療療效，改善患者臨床癥狀及減輕毒副反應[47]，改善術后上肢腫脹[48-50]等并發癥。本研究發現，桃紅四物湯治療乳腺癌的關鍵作用靶點（圖4）主要包括激素調節相關靶點ESR1、ESR2、PGR、PTGS2，以及EGFR，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移密切相關。（2）心血管相關疾病包括高血壓、心肌梗死、心臟衰竭等，均是血瘀證的常見疾病。臨床研究表明桃紅四物湯聯合苯磺酸氨氯地平片治療老年高血壓，可更有效地將血壓控制在正常值之內，進而降低臟器損害，避免并發癥[51]；桃紅四物湯合真武湯聯合化學藥，治療陽虛血瘀型慢性射血分數降低性心力衰竭患者具有良好的臨床效果，改善患者心功能[52]。本研究發現，桃紅四物湯治療心血管相關疾病作用的關鍵靶點（圖4）主要包括血管新生相關靶點VEGFA；激素調節相關靶點腎上腺素（ADRB1、ADRB2、ADRA2A、ADRA1D）、前列腺素（PTGS2、PTGIS）、雌激素（ESR1）。（3）本研究預測出桃紅四物湯可用于神經系統相關疾病如阿爾茨海默病的治療。阿爾茨海默病是一種不可治愈的神經退行性腦病，淀粉樣斑塊是其主要病理特征和臨床診斷指標；中醫認為淀粉樣斑塊沉積是“濁毒”的一個方面，可以被認為是中醫的“腦絡受損”范疇[53]。但網絡藥理學研究過程中沒有考慮成分血腦屏障的參數（lgBBB），故其作用需要進一步探索。

本研究通過網絡藥理學和分子對接，構建了其主要有效成分、作用靶點和通路、治療疾病的復雜網絡，一定程度上揭示了桃紅四物湯活血化瘀功效在臨床上異病同治的作用網絡，為桃紅四物湯的實驗研究和臨床應用提供了理論依據。然而篩選得到的成分只是考慮其活性和入血情況，并未衡量其在復方中的含量等問題，且只通過分子對接對主要成分和關鍵靶點進行了驗證。在此基礎上，可進一步通過體內、外實驗來驗證成分和靶點之間的作用關系，深入揭示桃紅四物湯的藥效物質基礎和作用機制，用現代科學語言詮釋傳統經典名方的科學內涵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突