淫羊藿苷元在大鼠體內的血漿動力學和組織分布研究

王 敏，谷 元，周 宇，武麗南，開躍義，耿雅杰，姚景春，王現珍*，司端運*

1.天津醫科大學，天津 300070

2.天津藥物研究院 釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300193

3.魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276000

4.中國醫學科學院藥物代謝新技術創新單元，天津 300193

隨著社會的發展和國家對中藥的高度重視，天然產物逐漸成為藥物研究的熱點，從天然產物中尋找活性成分或通過改善其結構，來獲取新的化學藥品已然成為新藥開發的一種重要途徑[1]。淫羊藿作為我國傳統中藥，約有上千年的應用歷史，具有治療骨質疏松[2-5]、抗癌[6]、抗腫瘤、提高免疫力[7]、治療老年癡呆[8]等作用，因其廣泛的藥理活性受到關注。

淫羊藿苷元是淫羊藿中主要藥效單體成分，屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物的基本母核為苯并吡喃酮（C6-C3-C6）的一類多酚化合物，以游離或與糖結合成苷的形式廣泛存在于多種植物中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、神經保護、清除自由基、抗炎、心血管保護等多種藥理活性[9]。盡管黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，但是由于其結構中的多酚羥基，使該類化合物在體循環血漿中主要以與葡萄糖醛酸或硫酸酯結合物的形式暴露，發揮藥效作用的游離黃酮苷元的暴露量很低，普遍被認為具有較低的生物利用度，限制了該類化合物的成藥性開發[10-12]。但是化合物在體內的真實濃度并不只是血藥濃度所表現的，其在體內的生物利用度和暴露水平與血藥濃度及組織濃度都有關系，而且組織中的存在形式更是直接影響藥效的發揮。淫羊藿苷或淫羊藿苷元在動物血漿和組織中濃度測定的相關研究已有報道[13-19]，但是尚沒有研究報道淫羊藿苷元及其II相代謝產物在血液循環系統和組織臟器中的暴露形式及相應暴露程度。

本研究通過LC-MS/MS建立大鼠血漿及組織中游離淫羊藿苷元及生物樣品經葡萄糖醛酸和硫酸復合酶水解后得到的總淫羊藿苷元的檢測方法，考察大鼠ig淫羊藿苷元后的絕對生物利用度、血漿動力學和組織分布特征，揭示淫羊藿苷元在血液循環系統和組織臟器中的暴露程度、暴露形式及暴露比例，為具有低血漿藥物暴露卻呈現良好體內藥理活性的黃酮類藥物開發提供依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑

淫羊藿苷元（質量分數99.33%，批號170601）、淫羊藿苷元納米晶（規格為27.4 mg/mL，批號181122）、淫羊藿苷元納米晶溶媒（羥丙甲纖維素E5LV和十二烷基硫酸鈉的混合物，批號分別為D011FBLL01和101420180501），均為山東新時代藥業有限公司產品；漢黃芩素（質量分數100%，批號111515-201706），中國食品藥品檢定研究院；β-葡萄糖醛酸酶（β-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶復合酶，批號SLBV4801），Sigma公司；磷酸二氫銨（色譜純，天津市立元化工有限公司，批號20150814）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司，批號分別為185366、186355）；正己烷（色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號190522）；甲基叔丁基醚（色譜純，美國Fisher公司，批號18100787）；甲酸銨（分析純，天津市光復精細化工研究所，批號20150313）；甲酸（色譜純，天津市大茂化學試劑廠，批號20181006）；甲酸（質譜級，Sigma-Aldrich公司，批號BCBP4740V）；超純水為實驗室自制。

1.2 儀器

高效液相色譜系統（含LC-30AD二元梯度泵、SIL-30AC自動進樣器、CTO-30A柱溫箱、DGU-20A5脫氣機，日本島津公司）；5500型三重四極桿串聯質譜儀（含Turbo ESI源、Analyst 1.5.2工作站，美國AB Sciex公司）；17R臺式高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；Turbo Vap LV型樣品濃縮儀，美國Caliper公司。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C8（100 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.5%甲酸-5%乙腈水溶液（B）（80︰20），等度洗脫，洗針水為乙腈-水（90︰10），體積流量為0.6 mL/min，柱溫50 ℃，進樣溫度6 ℃。

2.2 質譜條件

ESI離子源，負離子檢測；噴霧電壓為?4500 V；源溫度500 ℃；加熱氣和噴霧氣均為60 Pa；卷簾氣為20 Pa；出口電壓?17 V，入口電壓?10 V；掃描模式為多反應監測，淫羊藿苷元和內標漢黃芩素用于定量監測的離子對分別為 [M?H]?m/z367.1→309、283.1→162.9；碰撞能分別為?37、?39 eV；去簇電壓分別為?110、?140 V。

2.3 動物

7～9周齡SD大鼠36只，SPF級，190.5～298.5 g，雌雄各半，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0006、SCXK（京）2016-0011，大鼠飼養環境溫度為（25±2）℃，濕度為（50±10）%，12 h光照，晝夜交替，實驗方案經天津天誠新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會審核通過（批準號2019022501），實驗過程符合動物實驗的倫理要求。大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后3 h統一給食。

2.4 給藥溶液配制

劑量的選擇參考藥效學的量效關系，大鼠血漿動力學和組織分布以10 mg/kg ig給藥，iv以5 mg/kg給藥。大鼠ig給藥制劑為淫羊藿苷元納米晶供試品，加入空白溶媒（淫羊藿苷元納米晶溶媒）制成；大鼠iv給藥制劑為淫羊藿苷元原料藥，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入5%葡萄糖注射液（N,N-二甲基甲酰胺-5%葡萄糖注射液4∶1）稀釋，配制成溶液型制劑。

2.5 給藥、分組及樣品采集

2.5.1 血漿動力學 參考前期預試驗結果，依據總淫羊藿苷元及游離淫羊藿苷元大鼠ig給藥后的達峰時間、消除特點進行實驗設計。將12只SD大鼠，隨機分為2組，每組6只，分別ig（10 mg/kg）和iv（5 mg/kg）淫羊藿苷元，并于給藥后0.083 3、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、12、15、18、24 h自頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，并離心分離血漿，?20 ℃冰箱凍存至LC-MS/MS定量分析。實驗結束后，動物統一麻醉后脫頸椎處死。

2.5.2 組織分布 根據血漿動力學的特征，游離淫羊藿苷元和總淫羊藿苷元在0.292 h左右達到峰值，半衰期分別為0.812、2.73 h。設計組織樣本采集時間點分別0.25、2、9、18 h，包含藥物的吸收、分布、消除過程。將24只SD大鼠，隨機分為4組，分別為4個時間點，每個時間點6只，ig淫羊藿苷元（10 mg/kg），并于各時間點腹主動脈取血并立即脫頸椎處死動物，分別取血漿、腦、肌肉、脂肪、卵巢、子宮、睪丸、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸（十二指腸段）、骨髓。組織稱質量，剪刀剪碎，以1︰5（g/mL）的比例用純甲醇在冰浴條件下制備組織勻漿，–20 ℃冷凍保存待測。

2.6 樣品處理

2.6.1 血漿中的淫羊藿苷元

（1）游離淫羊藿苷元測定：吸取50 μL血漿樣品，加入150 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，渦旋1 min后，吸取150 μL，加入50 μL內標漢黃芩素甲醇溶液，1.2 mL提取劑甲基叔丁基醚-正己烷（2∶1），渦旋2 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上層有機相960 μL于玻璃試管中，40 ℃水浴氮氣吹干，加入100 μL復溶液（70%甲醇水溶液）渦旋復溶，取復溶后樣品于內插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，進行LC-MS/MS定量分析。

（2）總淫羊藿苷元測定：吸取50 μL血漿樣品，加入150 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，渦旋1 min，取30 μL加入125 μL 200 U β-葡萄糖醛酸酶混勻后，37 ℃孵育40 min后加入50 μL內標漢黃芩素，之后提取等步驟與游離淫羊藿苷元測定步驟相同。

2.6.2 組織中的淫羊藿苷元

（1）游離淫羊藿苷元測定：吸取50 μL組織勻漿樣品，加入50 μL甲醇，250 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，25 μL內標漢黃芩素甲醇溶液，1.2 mL提取劑正己烷-二氯甲烷-異丙醇（20∶10∶1），渦旋2 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。取上層有機相960 μL于玻璃試管中，40 ℃水浴氮氣吹干后，加入100 μL復溶液渦旋復溶，取復溶后樣品于內插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，進行LC-MS/MS分析。

（2）總淫羊藿苷元測定：吸取50 μL組織勻漿樣品，加入50 μL甲醇，40 ℃水浴氮氣吹干，加入250 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，50 μL β-葡萄糖醛酸酶混勻后，37 ℃孵育40 min，加入25 μL內標漢黃芩素甲醇溶液，之后提取等步驟與游離淫羊藿苷元測定步驟相同。

2.7 數據處理

血漿藥物濃度-時間數據采用WinNonlin 7.0軟件非房室模型統計矩法計算藥動學參數，其中血藥濃度-時間曲線下面積（AUC）采用梯形法計算，消除半衰期（t1/2）采用Best Fit法計算，峰濃度（Cmax）及達峰時間（Tmax）采用實測值。

3 結果

3.1 方法學驗證

血漿中淫羊藿苷元的LC-MS/MS定量分析方法經過了完整的方法學驗證，在該分析方法下，血漿中的內源性物質不會干擾待測物和內標的測定，總淫羊藿苷元和游離淫羊藿苷元的線性范圍分別為0.01～5 μg/mL和0.5～100 ng/mL，曲線斜率的變異系數均小于5.13%，相關系數大于0.99，表明在該范圍濃度內線性良好。定量下限分別為0.01 μg/mL和0.5 ng/mL，準確度在96.3%～108%，精密度小于9.52%。低、高2個質量濃度水平的基質效應在87.7%～105%，變異系數小于11.6%。

組織中淫羊藿苷元的LC-MS/MS定量分析方法分別選取3個代表性組織腦、心、肝進行了1個分析批的部分方法學驗證。組織中的內源性物質不會干擾待測物和內標的測定，總淫羊藿苷元和游離淫羊藿苷元的線性范圍均為2.5～1000 ng/g，相關系數大于0.99，表明在該范圍濃度下線性關系良好。定量下限為2.5 ng/g，準確度在103%～111%，精密度小于9.52%。低、高2個質量濃度水平的基質效應在61.9%～89.4%，變異系數小于9.16%。

血漿和組織中的方法學驗證結果均符合指導原則要求。

3.2 淫羊藿苷元的大鼠血漿動力學

大鼠ig給藥后血藥濃度-時間曲線見圖1。大鼠ig及iv給藥后的主要藥動學參數見表1、2。

圖1 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后游離淫羊藿苷元 (A) 與總淫羊藿苷元 (B) 的血藥濃度-時間曲線 (±s ,n=6)Fig.1 Plasma concentration-time curve of free (A) and total (B) icaritin after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

表1 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動學參數 (±s ,n=6)Table 1 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

表1 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動學參數 (±s ,n=6)Table 1 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

MRT為平均駐留時間MRT is the average resident time

參數 單位 游離淫羊藿苷元 總淫羊藿苷元Cmax ng·mL?1 12.90±5.77 3800±1110 Tmax h 0.292±0.102 0.292±0.102 AUC0-t h·ng·mL?1 12.00±8.01 5760±2200 AUC0-∞ h·ng·mL?1 16.80±6.89 5840±2180 MRT0-t h 0.743±0.266 2.580±0.510 MRT0-∞ h 1.130±0.257 2.910±0.558 t1/2 h 0.812±0.263 2.73±1.28 F % 1.42 96.0

大鼠ig給藥淫羊藿苷元后，吸收迅速，消除較快，在血漿中總淫羊藿苷元的暴露量明顯高于游離淫羊藿苷元，總淫羊藿苷元的Cmax和AUC0-∞分別是游離淫羊藿苷元的295倍和347倍，提示淫羊藿苷元在血液循環系統中只有少部分以原型的形式存在，大部分被代謝成為葡糖醛酸結合物和硫酸酯結合物。與大鼠iv淫羊藿苷元（5 mg/kg）相比，經劑量校正后，游離淫羊藿苷元的絕對生物利用度（F）為1.42%，總淫羊藿苷元的F為96.0%。

3.3 淫羊藿苷元的大鼠組織分布

大鼠ig給藥后各組織分布見圖2和表3。

3.3.1 游離淫羊藿苷元 大鼠ig給藥10 mg/kg，除腎、脂肪、肺在給藥后2 h達分布峰值外，其余組織中游離淫羊藿苷元均在0.25 h達分布峰值。隨后逐漸消除，給藥18 h后組織中的淫羊藿苷元已降至分布峰值的1/10或1/20以下，各組織的分布與血藥濃度的時間變化趨勢一致，未發現明顯的組織蓄積趨勢。大鼠ig給藥后，淫羊藿苷元在組織中分布藥濃度的時間變化趨勢一致，未發現明顯的組織蓄積趨勢。大鼠ig給藥后，淫羊藿苷元在組織中分布廣泛，所有被研究的組織中除睪丸外均可檢測到游離淫羊藿苷元。基于AUC0-t評價游離淫羊藿苷元在組織中的分布程度排序為胃、腸、肺（110～220倍血漿）＞肝、子宮（20～65倍血漿）＞心、卵巢、脾（4～15倍血漿）＞骨髓、腎、肌肉（1～2倍血漿）＞血漿＞腦、脂肪（20%～50%血漿）＞睪丸（未檢測到）。總體趨勢上組織中游離淫羊藿苷元的暴露量高于血漿。

表2 大鼠iv 5 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動學參數 (±s ,n=6)Table 2 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intravenous administration of icaritin (5 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

表2 大鼠iv 5 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動學參數 (±s ,n=6)Table 2 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intravenous administration of icaritin (5 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

Vd為表觀分布容積，CL為清除率Vd is the apparent volume of distribution,CL is the clearance rate

參數 單位 游離淫羊藿苷元 總淫羊藿苷元Cmax ng·mL?1 978±107 2390±295 AUC0-t h·ng·mL?1422±38 3000±932 AUC0-∞ h·ng·mL?1425±38 3080±884 MRT0-t h 0.531±0.049 3.740±0.702 MRT0-∞ h 0.599±0.093 4.500±0.649 Vd L·kg?1 28.5±14.9 10.4±7.4 CL L·h?1·kg?111.80±1.05 1.73±0.48

圖2 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后游離和總淫羊藿苷元的組織分布Fig.2 Tissue distribution profile of free and total icaritin in rats after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats

表3 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后各組織中游離和總淫羊藿苷元的暴露量比較 (n=6)Table 3 Comparison of free and total icaritin exposure in different tissues after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (n=6)

3.3.2 總淫羊藿苷元 大鼠ig給藥10 mg/kg，除睪丸、肺在ig給藥后2 h達分布峰值外，其余組織中總淫羊藿苷元均在0.25 h達分布峰值。隨后逐漸消除，給藥后18 h組織中的總淫羊藿苷元已降至分布峰值的1/10或1/20以下，各組織的分布與血藥濃度的時間變化趨勢一致，未發現明顯的組織蓄積趨勢。大鼠ig給藥后，總淫羊藿苷元在組織中分布廣泛，所有被研究的組織中均可檢測到結合型的淫羊藿苷元。基于AUC0-t評價總淫羊藿苷元在組織中的分布程度，從高到低排序為腸、胃、肺（1～2倍血漿）＞血漿＞肝、腎、子宮、卵巢（20%～60%血漿）＞肌肉、心、脾、睪丸、骨髓、脂肪、腦（1%～7%血漿）。總體趨勢上，除胃、腸外的各組織中總淫羊藿苷元的暴露量低于血漿。

大鼠灌胃淫羊藿苷元后，多數組織中游離淫羊藿苷元的暴露量、暴露時間明顯高于血漿，而且游離淫羊藿苷元與總淫羊藿苷元的比例明顯大于血漿。

4 討論

在測定大鼠血漿和組織中總淫羊藿苷元濃度時，進行了水解條件的考察和優化，分別對β-葡萄糖醛酸酶的濃度（0、50、100、150、200、300、500 U）以及孵育時間（0、10、20、30、40、60 min）進行了考察，最終確定酶濃度為200 U、孵育時間為40 min可以達到對總淫羊藿苷元的充分水解。

大鼠ig給予淫羊藿苷元后，血漿中游離淫羊藿苷元的濃度較低，游離淫羊藿苷元與總淫羊藿苷元暴露量比為0.208%，提示ig給藥后在大鼠的血液循環系統中淫羊藿苷元主要以II相結合型產物暴露為主。進一步結合大鼠iv給藥（5 mg/kg）的數據，ig給藥后以游離淫羊藿苷元形式計算的絕對生物利用度為1.42%，以總淫羊藿苷元形式計算的絕對生物利用度為96.0%，提示雖然淫羊藿苷元的絕對生物利用度偏低，但是其吸收分數并不低。除胃、腸外，多數組織中游離淫羊藿苷元的暴露量明顯高于血漿，總淫羊藿苷元的暴露量低于血漿。除睪丸外，其他組織中游離淫羊藿苷元與總淫羊藿苷元AUC0-18h比值（1%～95%）遠高于血漿（0.208%），即與血漿相比，游離的淫羊藿苷元在組織器官中的暴露量和暴露比例更高、持續時間更長。

淫羊藿苷元游離/結合形式暴露比例在血漿和組織中呈現出的懸殊差異，在其他類型的天然藥物和化學藥物的藥動學研究中鮮有報道。這一現象是淫羊藿苷元特有的，還是黃酮類化合物可能具有的共性，以及產生該現象的機制？是由于其II相結合物極性增大，膜通透性變差，不易于進入組織細胞，還是血液和組織中的結合/水解代謝酶的差異引起的？或轉運差異引起的？以上問題均需要進一步的研究和驗證，以便加快推動黃酮類化合物的成藥性開發。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突