白術內生細菌AM14的分離鑒定及其對宿主根腐病的防效研究

吳 威，劉世禹，王詩語，秦路平，朱 波

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311402

白術系菊科蒼術屬植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，是著名藥材“浙八味”之一，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效[1]。白術為常用補益類中藥，俗有“北參南術”“十方九術”之說，《黃帝內經》將其列為上品。白術在我國安徽、浙江、河南、湖南、四川等大部分地區都有栽培，其質量以浙江於潛白術為最佳，又稱“於術”[2]。現代化學與藥理學研究表明，白術富含多糖、倍半萜、甾醇、有機酸等活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、調節免疫等藥理作用[3]。

根腐病是白術常見病害，發生率在30%左右，嚴重時達60%～70%，甚至絕收，是白術生產發展的主要障礙之一[4]。白術根腐病是由多種病原菌復合侵染所致，主要致病菌包括尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、茄病鐮刀菌F.solani、半裸鐮刀菌F.incarnatum等[5]。目前，對于白術根腐病的防治主要集中在栽培管理以及化學防治，但存在費時費力、農藥殘留、污染環境及抗藥性等缺點[6]。

內生細菌是指生活在植物細胞內或細胞間隙并且不會造成宿主植物明顯病癥的細菌，由于植物內生細菌與病原菌生態位相似，而且使用內生細菌防治植物病害不會造成環境污染，因此采用內生細菌進行植物病害防治具有較好的應用前景[7]。如林星辰等[8]發現內生細菌B69可以高效定殖在人參根部組織，并且對人參根腐病有良好的防治效果，防治效果達到58.56%。荊卓瓊等[9]發現解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensHZ-6-3可以很好地防控番茄灰霉病。本研究從健康白術根、莖、葉和根莖中分離篩選得到能拮抗白術根腐病菌的內生細菌，進一步用盆栽試驗明確拮抗細菌的生防效果，并進行菌種鑒定，為應用內生細菌防治白術根腐病提供試驗依據。

1 材料

2019年9 月～10月，采集浙江磐安、浙江於潛，河南溫縣，湖南平江新鮮白術健康植株，由浙江中醫藥大學藥學院張巧艷教授鑒定為菊科白術A.macrocephala。白術病原菌尖孢鐮刀菌F.oxysporum和茄病鐮刀菌F.solani由浙江農林大學陳杰教授惠贈，半裸鐮刀菌F.incarnatum（CGMCC：3.14008）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

2 方法

2.1 內生細菌的分離純化

取白術組織（根、莖、葉、根莖），自來水洗凈，無菌濾紙吸干水分后，用3步消毒法進行表面滅菌[10]。將白術組織塊放入無菌研缽中，加入石英砂和20 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），充分研磨，取上清液100 μL涂布于瓊脂培養基（NA）培養基，置于28 ℃霉菌培養箱中暗培養。取最后一次漂洗液100 μL涂布于NA培養基作為對照組，于相同環境下暗培養，檢驗表面消毒是否徹底，試驗平行3次。采用劃線法對白術內生細菌進行純化，直至分離得到單一菌落。

2.2 抗根腐內生細菌篩選

用打孔器在病原菌菌落邊緣打取直徑為0.6 cm的菌餅，接種在馬鈴薯葡萄糖瓊培養基中央，用接種針挑取細菌在距離中心點2.5 cm處劃線，以只接種病原菌的平板為對照組，置于28 ℃的霉菌培養箱中暗環境培養5～7 d，將有抑菌作用的細菌標記為“＋”，無抑菌作用的標記為“－”，試驗平行3次[11]。挑取對3種病原菌均有抑菌作用的內生細菌到NB液體培養基中擴大培養，28 ℃，180 r/min，調整菌液濃度至1×107cfu/mL。將病原菌菌餅放置于PDA培養基中心，將直徑為0.6 cm的3張圓形無菌濾紙放置于距PDA中心2.5 cm處。滴加菌液濃度為1×107cfu/mL拮抗細菌5 μL于濾紙中。以只接種病原菌的平板為對照組，置于28 ℃的霉菌培養箱中暗環境培養5～7 d，試驗重復3次，計算抑菌率[12]。

抑菌率＝(對照菌落半徑－處理菌落半徑)/(對照菌落半徑－菌餅半徑)

2.3 內生細菌對盆栽白術根腐病的防治效果

將活化好的尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌用0.6 mm的打孔器制成菌餅，挑取15個病原菌菌餅加到含有250 mL的PDB液體培養基中，28 ℃，180 r/min，暗環境培養3 d，調整菌液濃度至1×107cfu/mL，取等量3種病原菌液混合過濾得到病原菌混合液。挑取適量拮抗細菌，接種到NB液體培養基，28 ℃，180 r/min，暗環境培養過夜，調整菌液濃度至1×107cfu/mL，即得拮抗菌液。

挑選8～10 cm的白術幼苗，采用灌根法對白術幼苗進行處理，設置3組，分別為對照組（無菌水10 mL）、白術根腐病模型組（病原菌混合液5 mL＋無菌水5 mL）和拮抗細菌處理組（病原菌混合液5 mL＋拮抗菌液5 mL）。設置每區組15株，每個處理3個區組。在接種第21天觀察白術幼苗的發病情況，計算病情指數和防治效果[13]。白術根腐病病情分級標準：0級，無病；1級，僅有少許根系受傷，枯死面積小于10%；3級，根系受傷明顯，枯死面積為10%～30%；5級，根系受傷明顯，枯死面積為30%～50%；7級，地上部開始萎蔫，根系嚴重受傷，枯死面積為50%～70%；9級，地上部嚴重萎蔫，根系嚴重受傷，枯死面積70%以上或整株死亡。

病情指數＝∑(各級病株數×相對病級數值)/調查總株數×9×100

防治效果＝(對照組病情指數－處理組病情指數)/對照組病情指數

2.4 內生細菌AM14的鑒定

2.4.1 形態特征與理化特征 觀察內生細菌菌落顏色，透明度，邊緣整齊度，光澤度和流動性，根據《常見細菌系統鑒定手冊》[14]對內生細菌進行革蘭染色、VP試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉水解活性、尿素酶活性、葡萄糖試驗、甘露醇試驗、木糖試驗、阿拉伯糖試驗、動力試驗、丙二酸鹽利用、枸櫞酸鹽利用、氧化酶試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗和尿素利用試驗。

2.4.2 分子鑒定 用細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN DP-30）提取拮抗細菌DNA。用細菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增細菌16S rRNA基因片段，反應體系如下：DNA樣本2 μL，DNA引物各1 μL，2×Taq Mix 21 μL，dd H2O補足體系到50 μL。用對其進行DNA擴增，擴增條件如下：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；最后在72 ℃下延伸5 min，終止反應。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA擴增產物特異性條帶，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

測序所得結果用NCBI數據庫中的BLAST工具進行同源性對比，MEGA軟件選取同源性＞97.0%的標準菌株和拮抗細菌進行多重比對，并選取相似性較低的Dokdonella fugitiva（NR 042397）作為外群分析。選擇鄰位連接法（neighbor joining）構建系統發育樹，采用重抽樣法（bootstrap test）對系統進化樹分支點的置信度進行評估，重復抽樣次數設置為1000[15]。

3 結果與分析

3.1 內生細菌的分離純化和拮抗細菌的篩選

共分離得到白術內生細菌246株，其中抗根腐內生細菌18株，AM14、AM65與AM201對3種根腐病菌均有拮抗作用（表1）。拮抗細菌在不同產地和組織部位中的分布存在差異，根中分離得到內生細菌58株，其中拮抗細菌10株，占總菌株數的4.07%。莖中分離得到內生細菌53株，拮抗細菌16株，占6.50%。葉中共分離內生細菌47株，拮抗細菌12株，占4.88%。根莖共有內生細菌88株，拮抗細菌28株，占11.38%。根莖中分離得到的內生細菌與拮抗細菌最多。產地方面，浙江於潛中分離內生細菌最多，為67株，其中拮抗細菌14株，湖南平江內生細菌56株，其中拮抗細菌數最多為19株（表2）。

表1 白術根腐病內生拮抗細菌的初步篩選Table 1 Preliminary screening of endophytic antagonistic bacteria against root-rot pathogen of A.macrocephala

表2 不同產地白術內生細菌與拮抗細菌的分布情況Table 2 Distribution of endophytic and antagonistic bacteria in A.macrocephala samples from four localities

3.2 抑菌率與抑菌帶測定

內生細菌AM14、AM65與AM201對尖孢鐮刀菌，茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌均具有顯著的抑菌效果，其中AM14對3種病原菌的抑菌效果最好，抑菌率分別為77.44%、84.93%和79.67%，抑菌帶分別為0.26、0.49、0.48 cm；AM65效果次之，抑菌率分別為74.87%、83.33%和75.52%，抑菌帶分別為0.19、0.41、0.35 cm（圖1和表3）。

圖1 白術內生細菌AM14、AM65與AM201對3種鐮刀菌屬病原菌的拮抗效應Fig.1 Antagonistic effects of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on hyphal growth of three root-rot pathogen Fusarium spp.

表3 白術內生細菌AM14、AM65與AM201對3種鐮刀菌屬病原菌的抑菌帶與抑菌率 (±s ,n=9)Table 3 Determination of inhibitory zone and inhibitory rate of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on hyphal growth of three root-rot pathogen Fusarium spp.(±s ,n=9)

表3 白術內生細菌AM14、AM65與AM201對3種鐮刀菌屬病原菌的抑菌帶與抑菌率 (±s ,n=9)Table 3 Determination of inhibitory zone and inhibitory rate of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on hyphal growth of three root-rot pathogen Fusarium spp.(±s ,n=9)

同列不同字母表示在P＜0.05水平存在顯著差異，表4同The different letters in one column indicated significant difference at P＜0.05 level,same as table4

菌株編號 抑菌帶/cm 抑菌率/%尖孢鐮刀菌 茄病鐮刀菌 半裸鐮刀菌 尖孢鐮刀菌 茄病鐮刀菌 半裸鐮刀菌AM14 0.26±0.02a 0.49±0.03a 0.48±0.01a 77.44±0.01a 84.93±0.01a 79.67±0.01a AM65 0.19±0.02a 0.41±0.05a 0.35±0.03b 74.87±0.01a 83.33±0.01a 75.52±0.01a AM201 0b 0b 0c 70.94±0.02b 74.47±0.03b 58.30±0.02b

3.3 內生細菌對盆栽白術根腐病的防治效果

接種AM14、AM65和AM201可顯著降低盆栽白術根腐病的病情指數。接種病原菌21 d后，模型組白術病情指數達90.37，但同時接種內生細菌后，白術病情指數得到不同程度緩解，其中接種AM14處理防治效果較好，為70.49%，與陽性對照甲基托布津防治效果相當，AM65與AM201的防治效果次之，分別為46.17%和30.60%（表4）。

表4 白術內生細菌AM14、AM65與AM201對宿主根腐病的防效研究 (n＝3)Table 4 Biological control of A.macrocephala endophytic bacteria AM14,AM65 and AM201 on host plant root-rot disease (n＝3)

3.4 內生細菌AM14的鑒定

3.4.1 形態與理化特征 內生細菌AM14在NA平板上呈乳白色，有光澤，不產生色素，表面光滑、濕潤、不透明、邊緣不平整有褶皺狀凸起，顯微鏡下菌體呈桿狀。AM14可以利用硝酸鹽、淀粉和明膠，具有運動能力，V-P試驗、尿素酶活性、氧化酶活性和革蘭氏染色結果呈陽性，不能利用尿素、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇、木糖、枸櫞酸鹽和丙二酸鹽，不產生吲哚和硫化氫（表5）。

表5 內生細菌AM14的理化特征Table 5 Physiological and morphological characteristics of endophytic bacteria AM14

3.4.2 分子鑒定 16S rRNA測序得到內生細菌AM14的擴增序列長度為1394 bp，在NCBI數據庫上進行BLAST比對，發現AM14與貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（MK660024）、死谷芽孢桿菌Bacillus vallismortis（MK149347）和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens（MK103120）的同源性均達到100%。用MEGA軟件構建系統發育樹和分析顯示（圖2），AM14與5株芽孢桿菌屬參考菌株聚為1支且與MN149347和MK103120親緣關系最近。綜合以上信息將菌株AM14鑒定為芽孢桿菌屬細菌Bacillussp.。

圖2 基于16S rDNA序列構建的白術內生細菌AM14的菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic analysis of AM14 strain of endophytic bacteria isolated from A.macrocephala

4 討論

本實驗首先對不同產地白術的內生細菌進行分離純化，得到內生細菌246株，其中抗根腐內生細菌18株，進一步通過抑菌率定量測定與盆栽防效試驗，篩選得到1株對白術根腐病具有較好防治效果的內生細菌AM14，并將其鑒定為芽孢桿菌屬細菌。AM14對白術根腐病菌尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和半裸鐮刀菌的平板對峙抑菌帶分別為0.26、0.49、0.54 cm，抑菌率分別為77.44%、84.93%、79.67%。盆栽防治試驗顯示AM14可以顯著降低白術幼苗根腐病病情指數，對白術根腐病防治效果達到70.49%。

不同產地白術內生細菌與拮抗細菌的分布存在差異性，拮抗細菌的菌株數量可能與不同產地白術的抗病性相關，也可能是產地氣候類型、經緯度、海拔、土壤等差異所致[16]。不同組織部位對白術拮抗細菌的分布也有影響，白術地下組織拮抗細菌較地上組織更為豐富，這可能是白術根及根莖中部分內生細菌來源于根際或土壤，同時白術地下部位需要招募更多的拮抗細菌來抵御根腐病病菌的侵染。

許多學者從藥用植物中分離得到了能提高宿主抗病性的內生細菌，其中以芽孢桿菌最為常見[17]。芽孢桿菌是一種好氧型，能夠產芽孢的革蘭陽性菌，呈桿狀，其在自然界中分布廣泛，易分離培養[18]。芽孢桿菌可以通過誘導植物系統抗性（induced systemic resistance）、與病原菌進行生態位競爭或分泌抗菌的代謝產物直接抑制病原菌生長等方法提高植物抗病性[19]。蘇博[20]發現杜仲內生細菌枯草芽孢桿菌DZSY21能上調誘導性系統抗性的水楊酸信號傳導途徑的關鍵基因類枯草菌素蛋白酶，茉莉酸信號傳導途徑關鍵基因茶樹脂肪氧合酶的表達，從而增強玉米對小斑病的抗性。

本實驗分離得到的內生細菌AM14為芽孢桿菌屬細菌，對白術根腐病表現出較好的防治效果，為白術根腐病的生物防治提供了候選菌種。本實驗只完成了AM14屬水平的鑒定，下一步將對AM14進行多位點測序，將其鑒定到種水平，并將AM14制備成生物菌肥進行大田試驗，進一步優化其對白術根腐病的生物防治效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突