羊躑躅八氫番茄紅素脫氫酶基因的克隆及表達(dá)分析

肖 政，蘇家樂(lè)，劉曉青，孫曉波，何麗斯，陳尚平，周惠民，李 暢

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014）

0 引言

羊躑躅(Rhododendronmolle(Blume)G.Don)又名黃杜鵑，是杜鵑花屬中極少數(shù)開(kāi)黃色花的珍稀物種[1]。杜鵑花作為中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，其花色繁多，觀賞期長(zhǎng)，然而黃色杜鵑品種卻很稀少，培育黃色杜鵑新品種是全世界杜鵑花育種工作者的一個(gè)共同目標(biāo)。由于杜鵑花種間花粉的親合性不同，多年來(lái)育種工作者嘗試不同親本雜交組合來(lái)選育杜鵑花黃色新品種，但一直沒(méi)成功。隨著基因工程技術(shù)快速發(fā)展，花色分子育種研究為培育杜鵑花新品種提供了新途徑。

類胡蘿卜素是構(gòu)成植物不同器官顏色的重要色素，主要分布于植物器官的色素細(xì)胞中，使花呈現(xiàn)黃色、橙色或紅色[2]。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)是植物類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化無(wú)色的八氫番茄紅素合成有色的類胡蘿卜素，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控花或果實(shí)中類胡蘿卜素的積累[3]。目前，PDS基因已經(jīng)在多種植物中被克隆和鑒別出來(lái)，如火鶴花(AnthuriumandraeanumL.)[4]、矮牽牛(Petuniahybrida)[5]、芝麻(SesameindicumL.)[6]、草莓(FragariaananassaDuch)[7]、向日葵(Helianthus annuusL.)[8]和水仙(Narcissustazettavar.chinensis)[9]等。研究發(fā)現(xiàn)PDS基因在番茄中超表達(dá)，可以促進(jìn)番茄果實(shí)中番茄紅素的積累[10]。PDS基因沉默后會(huì)產(chǎn)生光漂白表型，因此常被用作病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)體系的參照基因[11-12]。VIGS作為一種簡(jiǎn)單、快速、高效的研究植物基因功能的技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到植物的基因功能研究中[13]。Kumagai等首次利用煙草花葉病素(tobacco mosaic virus,TMV)在本氏煙(NicotianabenthamianaL.)中成功沉默了植物內(nèi)源PDS基因[14]。Jackie等[15]以PDS基因?yàn)閳?bào)告基因，利用VIGS技術(shù)研究小麥抗葉銹病基因Lr21的功能。目前，在杜鵑屬植物中還未見(jiàn)PDS基因的研究報(bào)道，研究PDS基因不僅可以為構(gòu)建杜鵑VIGS體系提供指示基因，而且對(duì)深入研究杜鵑花類胡蘿卜素代謝具有重要的意義。

本研究從羊躑躅花瓣中克隆獲得PDS基因的cDNA（命名為RmPDS），對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)研究該基因在羊躑躅花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特異性，擬為羊躑躅花色呈色機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院杜鵑花種質(zhì)資源圃的羊躑躅為材料，分別采集羊躑躅花蕾期(S1)、膨大期(S2)、初花期(S3)和盛花期(S4)的花瓣，用液氮速凍后，然后于-80℃低溫保存。

SMART RACE試劑盒購(gòu)于Clontech公司；Taq酶、克隆載體pMD18-T、DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)于全式金生物公司；植物RNA提取試劑盒購(gòu)于艾德萊生物技術(shù)有限公司；DNA回收試劑盒購(gòu)于愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 羊躑躅RNA的提取

采用柱式RNA提取試劑盒提取花瓣的RNA，用1.0%的變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.3 羊躑躅PDS基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析，從羊躑躅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到PDS基因片段序列。用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)3’-RACE特異引物GSP1:CACCTTCTCA GTGTGTATGCGGACAT，5’-RACE 特異引物 GSP2:ATTACCATTATTTAGCAAAAAGTTC。以羊躑躅花瓣的RNA為模板，按照Clontech公司的SMART RACE試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行3’-RACE-PCR和5’-RACE-PCR反應(yīng)。

取3 μL產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。按照Axygen公司的DNA回收試劑盒說(shuō)明切膠回收擴(kuò)增的特異性片段。將回收產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.ColiDH5α，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行搖菌，送南京金斯瑞公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與已經(jīng)獲得PDS基因片段序列進(jìn)行比對(duì)拼接，分別在序列5’-端和3’-端設(shè)計(jì)引物PDS-F：CCCGAATCTGAACTGCGTATTGT和PDS-R：GCACTCTTAGGGATTCGCTGTC進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)得結(jié)果與之前的全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)，確定獲得羊躑躅PDS基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

1.4 羊躑躅PDS基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI的Blast程序進(jìn)行同源比對(duì)分析和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，查找PDS基因cDNA開(kāi)放閱讀框。用ProtParam軟件計(jì)算PDS氨基酸的相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)和穩(wěn)定性[16]；用ProtScale分析蛋白的疏水性區(qū)域[17]；利用HNN軟件對(duì)推測(cè)氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[18]。

采用DNAMAN8軟件對(duì)羊躑躅和其他物種的PDS氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，用MEG4軟件對(duì)PDS氨基酸序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[19]。

1.5 熒光定量PCR檢測(cè)RmPDS基因表達(dá)

應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)RmPDS基因在羊躑躅不同時(shí)期（花蕾期S1、膨大期S2、初花期S3、盛花期S4）花瓣的表達(dá)情況。依據(jù)羊躑躅PDS基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量引物P1:ACGAATTGCTTGCTTCCCG和P2:TTGCCCAAATACCATGTATCTGC。內(nèi)參基因EF1-α的引物為EF1-F：AAGCGAGAAACATAGCGTGC和EF1-R:TCAAGACACTCATTGCTGCG[20]。

熒光定量PCR采用SYBRGreen PrimeScript RTPCR Kit試劑盒（日本Takara公司）。反應(yīng)在ABI7300上進(jìn)行，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；再進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)分別95℃5 s，60℃31 s。每個(gè)反應(yīng)樣本設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊躑躅花瓣總RNA提取

提取的羊躑躅花瓣總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量（圖1）。電泳結(jié)果顯示28S和18S條帶清晰，28S的亮度約為18S的2倍，表明提取的RNA濃度和純度可滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 羊躑躅花瓣總RNA電泳圖

2.2 RmPDS基因的克隆

將羊躑躅花瓣提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，依據(jù)羊躑躅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選PDS蛋白的基因序列片段序設(shè)計(jì)RACE特異引物GSP1和GSP2，利用RACE-PCR技術(shù)得到3’-端序列和5’-端序列（圖2-A、圖2-B）。將測(cè)序得到的5’-端序列，3’-端序列、中間片段進(jìn)行電子拼接，得到2098 bp的PDS基因全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物擴(kuò)增獲得羊躑躅RmPDS基因全長(zhǎng)序列（圖2-C），測(cè)序結(jié)果與電子拼接序列一致。

圖2 羊躑躅RmPDS基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

用ORF-Finder軟件對(duì)羊躑躅RmPDS基因序列進(jìn)行分析，該基因包含320 bp 3'-端非編碼區(qū)，35 bp 5'-端非編碼區(qū)及25 bp PolyA尾巴，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1743 bp（圖3），預(yù)測(cè)編碼580個(gè)氨基酸，在靠近N-端有一個(gè)二核苷酸結(jié)合域，靠近C-端有一個(gè)類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)域（圖4）。該基因已經(jīng)在GenBank登錄，登錄號(hào)為KX230462。

圖3 羊躑躅RmPDS基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖4 羊躑躅PDS與其他物種PDS氨基酸序列的同源性比較

2.3 PDS蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)ProtParam軟件預(yù)測(cè)羊躑躅PDS蛋白分子量為65.42 kD，分子式 C2961H4607N789O839S23，理論等電點(diǎn)(PI)為7.59，帶正電的堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為67，帶負(fù)電的酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為66，由此推斷該蛋白為中性蛋白。分析還發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定系數(shù)為39.98，推測(cè)屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)(Aliphatic index)為89.95，親水性平均系數(shù)(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.222，表明該蛋白是一個(gè)脂溶性且親水性的穩(wěn)定蛋白。

Protscale軟件分析結(jié)果表明羊躑躅PDS蛋白最大親水區(qū)域位于第155個(gè)氨基酸(Score:-2.667)，最大疏水性區(qū)域位于第115個(gè)氨基酸(Score:2.367)。由圖5可見(jiàn)，親水性殘基總數(shù)多于疏水性殘基，表明羊躑躅PDS蛋白為可溶性蛋白。

圖5 羊躑躅RmPDS基因疏水性/親水性預(yù)測(cè)

羊躑躅PDS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，占44.83%（圖6紅色區(qū)域），其次為α-螺旋占37.93%（圖6藍(lán)色區(qū)域）；延伸鏈占17.24%（圖6）。

圖6 羊躑躅PDS蛋白氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI Blast工具分析羊躑躅RmPDS基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因與其他植物的PDS基因高度同源。RmPDS基因與茶樹(shù)(Camelliasinensis(L.)Kuntze)PDS基因的相似性最高，達(dá)到87.80%，與葡萄(VitisviniferaL.)PDS基因的相似性為83.33%，與梅(PrunusmumeSiebold&Zucc)PDS基因的相似性為81.07%，與月季(RosachinensisJacq)PDS基因的相似性為80.45%。利用MEGA4軟件采用鄰接法對(duì)所選取的18種植物PDS蛋白序列和羊躑躅PDS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖7，單子葉植物水仙、水稻和玉米聚為一類，雙子葉植物羊躑躅、葡萄和煙草等聚為一大類，表明PDS基因的進(jìn)化基本符合植物分類學(xué)分類。其中羊躑躅RmPDS基因與茶樹(shù)PDS基因的遺傳距離最近，其次是葡萄(VitisviniferaL.)PDS基因、胡桃(JuglansregiaL.)PDS基因，與玉米(ZeamaysL.)PDS基因和水稻(OryzasativaL.)PDS基因的遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖7 不同植物的PDS氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.5 羊躑躅RmPDS基因在花瓣不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性分析

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示RmPDS基因在花瓣不同發(fā)育時(shí)期(花蕾期S1、膨大期S2、初花期S3、盛花期S4)均有表達(dá)。隨著羊躑躅花的發(fā)育，RmPDS基因表達(dá)量逐漸升高，在初花期達(dá)到最高，盛花期表達(dá)量有所降低（圖8）。

圖8 RmPDS基因在羊躑躅花瓣不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

本研究成功從羊躑躅花瓣中克隆獲得PDS基因全長(zhǎng)，該基因cDNA全長(zhǎng)2089 bp，開(kāi)放閱讀框序列為1743 bp，編碼580個(gè)氨基酸。該基因推導(dǎo)的氨基酸序列與茶樹(shù)、葡萄、梅和月季的相似性分別為87.80%，83.33%，81.07%，80.45%。利用MEGA4軟件分析植物PDS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)羊躑躅PDS與茶樹(shù)PDS蛋白親緣關(guān)系最近，另外單子葉植物與雙子葉植物分別聚為兩類，各小分枝的聚類與傳統(tǒng)的分類結(jié)果基本一致，說(shuō)明PDS蛋白可作為系統(tǒng)進(jìn)化分析。

PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，分兩步催化八氫番茄紅素合成ζ-類胡蘿卜素，對(duì)高等植物葉片、花和果實(shí)的顯色起著重要作用[21-22]。在柑橘和番茄的花或果實(shí)中，八氫番茄紅素脫氫酶表達(dá)量與花或果實(shí)中類胡蘿卜素含量呈正相關(guān)[23]。在柿子中，PDS基因表達(dá)量隨著果實(shí)發(fā)育逐漸升高，果實(shí)中類胡蘿卜素含量也同步升高[24]。在本研究中，RmPDS基因在羊躑躅開(kāi)花過(guò)程均有表達(dá)，表達(dá)量隨著花的發(fā)育逐漸升高，初花期達(dá)到最高，盛花期表達(dá)量有所降低，這與羊躑躅花發(fā)育過(guò)程中類胡蘿卜素的含量變化基本一致[25]，這表明RmPDS基因的表達(dá)與羊躑躅類胡蘿卜素的合成密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)控RmPDS基因的表達(dá)，可以影響羊躑躅類胡蘿卜素的積累，從而調(diào)控羊躑躅的花色形成。

類胡蘿卜素作為天線色素，主要分布在類囊體膜上，PDS基因以單拷貝形式存在，其蛋白也位于葉綠體的類囊體上[26-27]。類胡蘿卜素在光合作用中主要起到電子傳遞及光氧化保護(hù)劑的作用，PDS基因被沉默后，會(huì)引起葉片上出現(xiàn)白色斑點(diǎn)[28]。這種特性很適用于VIGS報(bào)告基因，檢測(cè)病毒載體是否適合侵染植物。目前VIGS技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水稻[29]、番茄[30]、馬鈴薯[31]和小麥[32]等作物上。杜鵑花屬植物生長(zhǎng)周期普遍較長(zhǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化難度大，VIGS技術(shù)有助于開(kāi)展杜鵑的基因功能研究。羊躑躅PDS基因的克隆可以為構(gòu)建羊躑躅VIGS體系提供報(bào)告基因，有助于開(kāi)展羊躑躅花色形成相關(guān)基因的功能研究。

本研究首次從羊躑躅中克隆獲得PDS全長(zhǎng)基因，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；并對(duì)PDS基因在羊躑躅花瓣不同發(fā)育階段的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，這為下一步探究該基因在羊躑躅花色形成中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為構(gòu)建羊躑躅VIGS體系提供支持。