靶向線粒體治療脊髓損傷的療效：基于動物實驗的系統評價

王麗群，龐日朝，劉建成，張安仁

1.成都中醫藥大學養生康復學院，四川成都市 610075；2.西部戰區總醫院康復醫學科，四川成都市 610083；3.同濟大學附屬上海市第四人民醫院康復醫學科，上海市200434

線粒體是一種雙膜細胞器，通過氧化磷酸化產生細胞的大部分三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)。線粒體的結構包括線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內膜和線粒體基質。線粒體外膜是一個磷脂雙層，包含電壓依賴性陰離子通道，該通道在打開時允許小分子通過，包括離子、二磷酸腺苷和ATP[1]。線粒體內膜的結構更加復雜，包含多個膜內通道，這些通道的開放受到嚴格控制，其調節電子傳輸鏈(elec?tron transport chain,ETC)以保持ATP 合成所必需的電化學梯度[2]。ETC 由四個膜結合的復合體和兩個載體分子(輔酶Q 和細胞色素C)組成。復合體包括：復合體I、復合體Ⅱ、復合體Ⅲ和復合體Ⅳ。線粒體可以充當能量儲存器，調節細胞內Ca2+的水平，并在依賴于線粒體的鈣緩沖和ATP 產生的神經元中起著重要的作用[3]。

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發癥，往往導致毀滅性和持續性的功能喪失。脊髓損傷具有復雜的病理過程，一般分為原發性損傷和繼發性損傷兩個階段。繼發性損傷由原發性損傷逐漸發展而來，對脊柱組織產生進一步的化學和機械損傷。脊髓損傷早期繼發性反應是去極化和電壓依賴性離子通道的打開，導致谷氨酸受體的激活，大大增加谷氨酸的濃度，并產生持續的興奮性毒性和細胞死亡，壞死細胞中高水平的谷氨酸鹽通過增加細胞內Na+和Ca2+的濃度并降低細胞內K+的濃度來改變離子通量[4]。Ca2+積累過多，將觸發線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permea?bility transition pore,mPTP)，mPTP 的開放會干擾質子梯度，使ATP 失活，增加水和其他分子進入線粒體基質，導致細胞腫脹并最終死亡[5]。正常情況下，電子從ETC 泄露并與線粒體基質的氧氣結合形成活性氧，內源性抗氧化系統可防止活性氧，引起毒性。然而，脊髓損傷可導致ETC受損和能量不足，形成過多活性氧，超過抗氧化系統的可控范圍，最終導致氧化損傷和病理水平。活性氧促使強氧化劑過氧亞硝酸鹽生成增加，誘導線粒體內一氧化氮合酶的活化，同時還可以觸發細胞膜脂質過氧化、蛋白質羰基化和酪氨酸硝化，進而損傷線粒體并造成線粒體功能障礙[6]。另外，線粒體功能障礙還會導致細胞色素C 釋放到細胞質中并造成細胞凋亡[7]。中樞神經系統所需的大部分能量由線粒體提供，而神經元的生存則需要足夠的能量。因此，脊髓損傷后的線粒體功能障礙可能導致神經元死亡，加劇損傷[8]。

脊髓損傷具有復雜的病理生理過程，目前有眾多改善脊髓損傷的治療方法，包括手術治療、藥物治療、細胞移植和納米技術等[9?12]。然而，目前臨床上仍未找到確切、有效的方法[13]，無論是傳統的手術干預和藥物治療，還是新型的細胞移植和納米技術，均存在其不可避免的缺陷。在神經元中，線粒體在鈣穩態、控制膜興奮性以及神經傳遞和可塑性中起著重要作用。由于神經元特別依賴于線粒體的鈣緩沖和ATP產生，因此對線粒體缺陷高度敏感。越來越多的證據表明，線粒體功能障礙參與多種疾病的發病機制，尤其是晚發性神經退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓氏病等[14]。脊髓損傷后線粒體維持體內穩態的能力降低，導致ATP 依賴性細胞功能喪失、鈣超載、興奮性中毒和氧化應激的喪失，進而加劇損傷[15]。以上研究表明，線粒體功能障礙與脊髓損傷導致的有害繼發性病理生理密切相關。因此，損傷后線粒體功能的恢復可能是治療脊髓損傷的潛在有效方法。可以通過不同方法直接靶向脊髓損傷后線粒體功能障礙，包括通過使用替代性能源、抗氧化、抗凋亡、抑制mPTP 和增強線粒體生物發生等多種機制靶向線粒體藥理學方法(表1)。靶向線粒體治療脊髓損傷可能改善的功能和相關評定方法或指標見表2。本研究收集國內外已發表的靶向線粒體治療脊髓損傷動物實驗，對靶向線粒體治療脊髓損傷的作用進行系統綜述，為今后臨床治療脊髓損傷提供實驗依據和新思路。

表1 靶向線粒體治療脊髓損傷的作用機制及其相關藥物

表2 靶向線粒體治療脊髓損傷涉及的功能結局和相關評定方法或指標

1 資料與方法

1.1 文獻檢索

檢索PubMed、Web of Science、中國知網和萬方數據知識服務平臺，檢索年限自建庫至2021 年2 月。中文檢索詞：脊髓損傷、線粒體、功能障礙、治療等；英文檢索詞：spinal cord injury、mitochondria、dysfunction、treatment等。

1.2 納入標準

疾病及動物種屬：脊髓損傷動物模型，不限制動物種屬和造模方法。

干預措施和對照措施：靶向線粒體治療的藥物干預和安慰劑或其他對照。

主要結局指標：脊髓損傷動物的運動功能(BBB評分)、脊髓組織病理學(受損組織和殘余組織面積)、抗氧化功能、抗凋亡功能、線粒體生物發生。

1.3 排除標準

①非干預類動物實驗；②非對照研究；③數據不完整；④非中、英文；⑤重復發表。

1.4 文獻篩選與資料提取

由2 名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對。如有分歧，則通過討論或與第三方協商解決。文獻篩選時首先閱讀文題和摘要，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀全文，確定最終納入的研究。文獻篩選流程見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

閱讀全文后由兩名研究者獨立提取相關數據并交叉核對。提取以下內容。①納入研究的基本信息：第一作者、發表年份、樣本量、實驗動物的種屬及模型種類、干預方式等。②結局指標：脊髓損傷動物的運動功能(BBB評分)、脊髓組織病理學(受損組織和殘余組織面積)、抗氧化能力、抗凋亡能力、線粒體的生物發生等。

1.5 文獻質量評價

偏倚風險評估：采用基于Cochrane偏倚風險評估工具制定的SYRCLE 動物實驗偏倚風險評估工具(SYRCLE's risk of bias tool for animal studies)[26]，包括6種偏倚類型(選擇偏倚、實施偏倚、測量偏倚、失訪偏倚、報告偏倚和其他偏倚)和10 個條目，評估結果最終以“是”、“否”和“不確定”表示，其中“是”代表低風險偏倚，“否”代表高風險偏倚，“不確定”代表不確定風險偏倚。

證據質量評估：采用CERQual (Confidence in the Evidence from Reviews of Qualitative research)[27]進行評估。CERQual 工具從4 個方面進行評估：①方法學局限性；②相關性；③一致性；④數據充分性。綜合以上4 部分的評價結果對系統評價單個結果進行信度分級(高、中、低、極低）。

1.6 統計學分析

由于納入的動物實驗研究存在臨床異質性和方法學異質性，難以進行定量分析，故僅進行定性分析。

2 結果

初步檢索得到相關文獻757 篇，其中英文653 篇，中文104 篇。經逐層篩選，最終納入11 篇動物實驗，其中中文3篇，英文8篇。文獻篩選結果見圖1。

2.1 納入文獻的基本特征

納入的11篇文獻[28?38]的基本特征見表3。

表3 納入研究的基本特征

2.2 質量評價

2.2.1 偏倚風險評估結果

根據SYRCLE 動物實驗偏倚風險評估工具對納入研究進行評價。11項研究都對實驗動物基線情況進行報道，平行可比。文獻均提及“隨機”或“隨機對照試驗”，但其具體的隨機化方法和是否采取適當的方法來實現隨機序列的不可預測性尚不清楚。7 項研究交代對飼養者和研究者實施盲法；7 項研究報告對結果評價者實施盲法；所有研究均對動物進行隨機化安置；7項研究對結局指標進行隨機評估；9項研究的數據報告完整。見表4。

表4 納入研究的偏倚風險評估結果

2.2.2 CERQual證據質量評估結果

CERQual 證據質量評估結果5 個結局指標中，證據質量為高、中和低。證據質量降級的原因包括原始研究的方法學限制、概括性較差和較多數據無法進行合并和轉化等。見表5。

2.3 系統評價結果

11 項研究中，6 項研究選用雄性或雌性Sprague?Dawley 大 鼠[28?31,34?35]，其 余5 項研究 選擇其 他種屬鼠[32?33,36?38]，8 項研究大鼠體質量150～275 g[28?29,31?36]，所有研究的脊髓損傷動物模型集中于T9～T11挫傷性脊髓損傷，但使用的脊髓打擊器和打擊力度存在差異。研究的干預措施存在較大異質性，干預藥物的種類、使用時間、頻率、濃度和劑量等均不相同。在對照組中，5 項研究使用生理鹽水[28?29,32,34,36]，2 項研究使用空白對照和相互對照[33,35]。由于納入研究在動物種屬、動物模型和結局指標測量等方面存在較大的異質性，因此無法對不同研究數據進行Meta 分析，只進行定性描述。

2.3.1 運動功能

9 項研究報告運動功能，其中7 項研究采用BBB評分評估運動功能，發現與對照組動物相比，實驗組動物的BBB 評分更 高[28?30?31?36,38]。Springer 等[31]在BBB評分基礎上，還利用DigiGait 圖像分析系統，顯示與假手術動物相比，安慰劑對照組在站立階段花費的步幅持續時間百分比顯著增加，但在Neu2000 治療后顯著減少(與安慰劑對照組相比)。另外，分別有一項研究采用BSM 評分[21]和Rivlin 斜板實驗[20]，結果顯示，與對照組相比，實驗組動物運動功能改善。

2.3.2 組織病理學

8 項研究報告脊髓組織病理學，其中3 項研究采用HE 染色[29,34?35]，5 項研究采用鉻花青染色[28,32,36?38]，5項研究進行定量分析脊髓受損組織和殘余組織體積[28,32,36?38]，與對照組相比，在整個脊髓橫斷面上治療組受損組織體積較小，殘存體積有所增加。但Spring?er 等[31]報告，與對照組相比，NIM811 的20 mg/kg 和40 mg/kg 劑量均顯著降低病變的平均體積，10 mg/kg的實驗組卻沒有。

表5 納入研究的CERQual證據質量評估結果

2.3.3 抗氧化功能

6 項研究報告抗氧化功能，其中4 項報告MDA 和SOD[29,31,33,35]，分別有2 項報告GSH?Px[33,35]和CAT[31,35]，與對照組相比，實驗組在干預后血清MDA 水平降低，SOD、GSH?Px和CAT水平增加。

2.3.4 抗凋亡功能

2項研究報告抗氧化功能，均采用TUNEL染色進行檢測。與對照組相比，實驗組在干預后細胞凋亡指數降低[29]，逆轉凋亡相關蛋白(Smac/Diablo、細胞色素C、FAS 配體、腫瘤壞死因子?α、缺氧誘導因子?1α、P53、Bax和Bcl?2等)的表達[34]。

2.3.5 線粒體生物發生

3 項研究報告線粒體的生物發生，其中1 項報告線粒體呼吸速率和關鍵線粒體酶復合物的活性，結果顯示與對照相比，實驗組干預顯著保持了線粒體的呼吸和酶活性，即維持線粒體的生物能[28]。1 項報告損傷部位的線粒體DNA 和蛋白質含量，結果顯示與假對照組相比，脊髓損傷后3 d，損傷和周圍損傷部位的線粒體DNA 含量降低約45%；LY344864 減輕了損傷部位DNA的減少，并且增加線粒體DNA含量(相較于對照組)[37]。1項報告線粒體生物發生相關蛋白PGC?1α，脊髓損傷后骨骼肌中PGC?1α 降低，但經實驗組干預后可增加[38]。

3 討論

本研究納入11項動物實驗進行系統評價，結果顯示，靶向線粒體治療脊髓損傷可以促進損傷后的運動功能恢復，減少脊髓受損組織和增加殘存組織體積而發揮神經保護作用，可能是通過替代性能源、抗氧化、抗凋亡、抑制mPTP 和增強線粒體生物發生等多種作用機制實現。

本研究納入文獻的動物基線和造模方法差異較大。動物的種類、品系、性別、年齡和體質量等基線情況對實驗影響較大，納入研究的動物主要為Sprague?Dawley 大鼠，脊髓損傷動物模型主要為T9～T11挫傷模型，但造模設備和造模參數存在很大差異。這是由于脊髓挫傷模型是建立最早的脊髓定量損傷模型，是模擬臨床急性脊髓損傷的理想模型[39?40]。該主要用于模擬臨床上因暴力撞擊而導致的脊髓損傷，其損傷后會造成炎癥、缺血和脊髓空洞形成等，是實驗性脊髓損傷的標準造模技術[41]。但是由于動物模型需要考慮眾多臨床需要，脊髓挫傷模型的造模設備和造模參數存在很大差異。脊髓損傷的不同實驗模型在研究病變發展、恢復機制和潛在治療干預措施的不同方面時各有利弊，但靈長類脊髓損傷動物模型可以幫助開發與人類更相關的有效方法[42]。未來應當針對不同動物種屬和損傷模型，進一步深入研究以促進臨床轉化。

納入的文獻干預措施差異較大。干預藥物的種類、使用時間、頻率、濃度和劑量等均不相同。納入研究的干預藥物包括ALC、α?生育酚、米諾環素、痿證中藥方、NIM811、LY344864 和福莫特羅等[28?38]。各種藥物的藥理作用、干預藥物濃度(2 mg/kg、25 mg/kg、90 mg/kg 和300 mg/kg)[28,31?33,37]、開始使用時間(術后即刻、15 min、30 min、1 h 或8 h)[28,32,34,37]、使用頻 率(1 次/d、1 次/周 和2 次/周)[29,31]、持續時 間(6 d、30 d、5 周和6 周)[29,31?32,35]等均不相同。未來應該針對同種脊髓損傷模型和干預藥物，對藥物濃度、劑量、使用時間和頻率進行深入藥代動力學分析，盡早進行臨床轉化。

本研究納入文獻CERQual證據質量等級不高，結局指標抗凋亡功能和增強線粒體生物發生評估為“低”等級，存在選擇、實施、測量和失訪偏倚。未來應納入規范設計和實施標準的動物實驗。

本研究局限性：①只納入公開發表的中、英文文獻，存在一定語言偏倚；②對灰色文獻的檢索不夠全面，可能存在漏檢和產生偏倚；③納入研究沒有進行功效分析以確定樣本量大小，基線資料的比較不夠詳細；④某些研究未交代清楚隱蔽分組和對動物飼養者及結果評價者施盲，可能產生盲法偏倚；⑤由于納入研究在實驗研究設計、干預措施和結局指標等多方面的異質性，本研究無法對納入研究數據進行定量分析；⑥某些研究質量較低，可能存在發表偏倚。

綜上所述，靶向線粒體治療脊髓損傷可以改善損傷后的運動功能，減少脊髓受損組織和增加殘存組織體積而發揮神經保護作用，其可能是通過替代性能源、抗氧化、抗凋亡、抑制mPTP 和增強線粒體生物發生等多種作用機制實現。受納入研究數量和質量的限制，上述結論尚待更多高質量研究予以驗證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。