豬源蓋塔病毒Cap蛋白與E2蛋白多克隆抗體的制備及其免疫特性分析

蘇靖茵，燕詩雨，張萌，粟碩

(南京農業大學免疫研究所，江蘇 南京 210095)

蓋塔病毒(Getah virus, GETV)是典型的蟲媒病毒，最早于1955年從馬來西亞的白雪庫蚊中分離并命名，隨后陸續又從豬群、馬群中分離出該病毒。近年來，世界各國出現母豬感染零星病例，而在2017年中國湖南豬場出現母豬和仔豬蓋塔病疫情[1]。臨床上，GETV對豬和馬的侵害性較大，他們的癥狀主要表現為發熱、浮腫等[2]。GETV在國內外均有流行，且我國陸續報道除馬、豬以外的多種動物(牛和狐貍等)感染病例[3]。

GETV是單股正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬的成員。GETV全基因組長11～12 kb，包含2個開放閱讀框，分別編碼非結構蛋白和結構蛋白。GETV的5個結構蛋白分別是C、E3、E2、6K和E1。在甲病毒中，Cap蛋白是一種多功能蛋白，包含N端RNA結合域和C端結構域[4]。Cap蛋白能與病毒基因組特性結合，這會影響病毒核衣殼形成和RNA合成[5]。此外，Cap蛋白不僅能促進核衣殼組裝過程中Cap蛋白二聚作用，還能促進在出芽過程中與糖蛋白細胞質結構域的相互作用[6]。E2是糖蛋白，分子量約為50 kDa；pE2是E2的前體，能裂解成E2和E3[5]。在甲病毒粒子感染過程中，E2作為介導病毒進入宿主細胞的主要蛋白。

GETV的Cap蛋白與E2蛋白可能在病毒感染和病毒復制中起重要重要作用。但現今對于GETV的病毒蛋白與及致病機制等研究仍較少[7]，而GETV的抗體能促進其相關研究。因此，本文通過了原核表達Cap和E2蛋白并制備了GETV的多抗，以用于GETV的基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero、BHK細胞和pET-32a(+)載體均為本實驗室保存。DH5α與BL21(DE3)感受態均購自康為公司。GETV由本實驗室分離純化后保存。6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物公司。

限制性內切酶購自NEB公司；DNA Marker購自TaKaRa公司；胎牛血清、DMEM培養基、標準蛋白Marker均購自賽默飛公司；高保真DNA聚合酶、同源重組連接試劑盒，化學發光試劑(ECL)顯色液均購自諾唯贊公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠抗體、HRP標記的山羊抗兔抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗鼠的抗體均購自KPL公司；His兔源抗體購自ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

以GenBank中登錄的GETV毒株NC_006558.1為參考毒株，設計E2基因糖蛋白區域和Cap基因編碼區特異性引物。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 GETV-Cap基因和GETV-E2基因擴增引物

1.2.2 目的基因的擴增

Vero細胞長至80%～90%時，接種GETV，細胞出現病變后，加入TRIzol裂解細胞。按照TRIzol試劑說明書，提取細胞培養物中病毒的RNA。使用RT-PCR方法擴增Cap基因及E2基因，反應體系為50 μL，反應條件為：94 ℃，4 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，38 個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物凝膠電泳后，回收目的片段。

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1.2.3 原核表達質粒的構建

空載體pET-32a(+)經EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切后回收載體。使用同源重組酶將回收目的片段與回收后的載體連接。連接產物轉DH5α，并涂布于含氨芐抗性的平板，37 ℃培養12～16 h。挑取單菌落，37 ℃擴培后，提質粒雙酶切(EcoRⅠ與HindⅢ)鑒定。根據酶切鑒定的結果，將陽性克隆送公司測序，鑒定正確后獲得質粒pET-Cap和pET-E2。

1.2.4 Cap與E2原核表達

將空載體pET-32a(+)、pET-Cap和pET-E2質粒分別轉入BL21(DE3)感受態中，挑取單菌落獲得pET-32a(+)、pET-Cap和pET-E2表達菌種。將pET-Cap 和pET-E2 菌種接種至含氨芐抗性的LB培養基中，37 ℃培養至菌液OD600值為0.6～0.8。摸索誘導條件分別為：誘導溫度為37、25 和16 ℃；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)濃度為0.5、1.0 和1.5 mmol/L；誘導時間為3、5和7 h。選取較優誘導條件，誘導后取菌體超聲約30 min至菌體清亮。12 000 r/min離心，分離上清與沉淀。將沉淀溶于包涵體溶解液中，4 ℃過夜，具體操作參考文獻[8]。SDS-PAGE分析pET-Cap和pET-E2原核表達蛋白主要分布于包涵體中。把原核表達蛋白經鎳柱親和層析純化，通過SDS-PAGE分析純化效果。純化后的蛋白使用脲素梯度稀釋法進行透析復性，4 ℃，12 h/次，前后經過復性液1～4，具體操作參考文獻[9-10]。將復性蛋白和誘導空載體分別制備成蛋白樣品，SDS-PAGE分析后，半干轉至硝酸纖維素膜(NC膜)；5% 脫脂奶封閉后，孵育His抗體和HRP標記的山羊抗兔抗體，ECL發光顯色。

1.2.5 小鼠多抗血清制備

復性的Cap和E2蛋白分別作為免疫原，經皮下背部多點方式，100 μg/只，免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠。首免免疫原和等體積完全弗氏佐劑乳化，而二免和三免用不完全弗氏佐劑替代完全弗氏佐劑。每次免疫間隔為2周，三免后1周采血，分離免疫小鼠血清作為陽性血清，不免疫小鼠血清作為陰性血清。ELISA測定血清效價，分別測定梯度稀釋后的陽性血清效價，操作參照文獻[11]，酶標儀讀取各孔的OD值。

1.2.6 Westeron blot鑒定

BHK細胞以感染復數(MOI) 0.01接種GETV，細胞病變后48 h，制備接種與不接種GETV的蛋白樣品，細胞裂解后收集樣品，加入4×上樣緩沖液后煮樣。經SDS-PAGE分析后轉至NC膜；封閉NC膜后，孵育Cap和E2 陽性血清一抗和HRP標記的山羊抗鼠二抗；洗膜后，ECL發光顯色。

1.2.7 免疫熒光試驗(IFA)鑒定

BHK細胞長至80%以上時，以MOI為0.01接種GETV，48 h后使用冰甲醇固定細胞。封閉后，分別與 E2、Cap血清和PBS(對照組)作用；接著以FITC標記的山羊抗鼠的抗體為二抗孵育，并使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，最后倒置顯微鏡下觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 PCR目的條帶擴增與質粒構建

以GETV的cDNA為模板，通過Cap特異性引物，RT-PCR方法擴增出約800 bp的片段(圖1A)，與GETV的Cap基因理論值(804 bp)相符；通過E2特異性引物，用RT-PCR方法擴增出約1 200 bp的片段(圖1B)，與GETV的E2基因理論值(1 209 bp)大小一致。

M. DNA Marker DL2000；1. Cap基因；2. E2基因

2.2 重組質粒的構建與鑒定

同源重組酶將目的片段與雙酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)的pET-32a(+)連接，構建成重組克隆質粒。分別使用Cap和E2的特異性引物，以Cap陽性質粒和E2陽性質粒為模板，分別擴增出804 bp與1 209 bp的單一條帶。質粒酶切鑒定結果顯示，空載體酶切后可見大小為5 900 bp條帶；Cap陽性質粒有5 900和804 bp 2條帶；E2陽性質粒有2條分別在5 900和1 209 bp附近的條帶，均符合預期(圖2)。將陽性質粒送公司測序，測序結果與原始序列比對一致，分別命名為pET-Cap和pET-E2。

M1. DNA Marker DL2000；M2. DNA Marker DL5000；1.雙酶切pET-Cap質粒；2.Cap基因擴增；3.雙酶切空載體；4.雙酶切pET-E2質粒；5.E2基因擴增；6.雙酶切空載體

2.3 重組蛋白的表達與純化

通過比較不同條件下誘導pET-Cap情況，最終選擇誘導條件為：IPTG濃度為1 mmol/L，37 ℃，誘導3 h。誘導后包涵體中40～55 kDa附近有明顯條帶，而上清僅有少量蛋白，表明Cap蛋白主要在包涵體中大量表達(圖3A)。包涵體中的蛋白經鎳柱親和層析純化后獲得重組Cap蛋白(圖3B)。純化復性后Cap蛋白樣品與His抗體結合，在40～55 kDa附近有條帶，純化復性蛋白為重組Cap蛋白(圖3C)。

A.pET-Cap表達：M.標準蛋白Marker；1. pET-Cap未誘導；2.pET-Cap誘導；3.pET-Cap超聲后上清；4.pET-Cap超聲后沉淀；B.Cap蛋白純化：M.標準蛋白Marker；1.純化pET-Cap沉淀；2.復性Cap蛋白；C.Cap蛋白與His抗體反應：M.標準蛋白Marker；1.復性Cap蛋白；2.pET-32a(+)誘導

通過分析比較不同溫度、時間與不同濃度的IPTG誘導pET-E2的效果，IPTG濃度為1 mmol/L時，在25 ℃，誘導5 h下E2蛋白大量表達，55～70 kDa附近有蛋白帶，且蛋白主要存在于包涵體中(圖4A)。經鎳柱親和層析純化和復性透析包涵體中蛋白后，獲得重組E2蛋白(圖4B)。純化復性后的E2蛋白與His抗體反應，在55 kDa處有明顯條帶而空載體沒有，表明純化復性的蛋白為重組E2蛋白(圖4C)。

A.pET-E2表達：1. pET-E2未誘導；2.pET-E2誘導；3.pET-E2超聲后上清；4.pET-E2超聲后沉淀；M.標準蛋白Marker；B. E2蛋白的純化：1. 純化pET-E2沉淀；2.復性E2蛋白；C. E2蛋白與His抗體反應：1.復性E2蛋白；2.pET-32a(+)誘導

2.4 Cap蛋白與E2蛋白多克隆抗體的制備

Cap與E2原核表達蛋白分別免疫小鼠制備多克隆抗體，經3次免疫后ELISA檢測小鼠血清抗體效價，結果2種抗體效價均達到1∶105以上。

2.5 Western blot 驗證多抗效果

GETV的Cap蛋白理論大小約為30 kDa，BHK(圖5A)和Vero(圖5C)細胞接種病毒后不同時間點的樣品在25～35 kDa附近可見有明顯條帶，而不接種病毒樣品未見條帶，說明Cap多抗能與GETV發生特異性結合。

GETV的E2蛋白理論大小為46 kDa，其前體pE2為62 kDa。BHK(圖6B)和Vero(圖6C)細胞接種病毒后不同時間點的樣品在40～55 kDa與55～70 kDa附近均可見明顯條帶，而不接種病毒樣品未見條帶，說明E2多抗與GETV的反應性良好。

M.蛋白標準Marker；1.BHK細胞接種GETV；2.BHK細胞不接種病毒

2.6 IFA驗證多抗效果

GETV接種于BHK細胞，以Cap多抗和E2多抗為一抗進行IFA，均可檢測到綠色熒光，而對照組沒有綠色熒光，說明Cap多抗和E2多抗能特異性識別GETV(圖6)。

圖6 Cap和E2多抗與GETV反應性的IFA鑒定(標尺=500 μm)

3 討論

GETV在我國廣西、四川、云南、海南、河北、湖南和甘肅等多地均有報道，表明該病毒在我國普遍流行[12]。在自然界中，GETV是一種蟲媒病毒，帶毒蚊蟲通過叮咬豬、馬、鼠等易感動物，使病毒在這些動物體內增殖[13]。Li等[14]對家畜血清樣本進行調查后，發現在雞、鴨、奶牛、豬和肉牛中均能檢測GETV的中和抗體，其中豬和肉牛抗體陽性率較高(46%～72%)。2010年在河北省涉縣出現正常人群和發燒患者感染GETV情況，流行病學篩查后發現正常人群的總感染率高達16.67%，遠高于海南瓊中地區的陽性率(約2.0%)[15]。這說明GETV可能具有重要的公共衛生學意義。

近年來對甲病毒的功能報道較多，而GETV的報道相對較少。研究發現甲病毒囊膜蛋白E2存在糖基化位點、宿主細胞受體識別位點和中和抗體的識別位點[5]。甲病毒科辛德比斯病毒(Sindbis virus)E2蛋白單抗能夠影響病毒在體內和體外的復制[16]。E2單抗處理后感染病毒，盡管細胞內核衣殼蛋白和囊膜蛋白仍持續合成，但病毒粒子釋放減少[17]。甲病毒囊膜糖蛋白E2蛋白C端接觸的是由Cap蛋白和基因組RNA組成的病毒核衣殼[6]。一旦核衣殼蛋白從初生的多肽鏈中釋放出來，N端信號序列將發揮作用，導致糖蛋白pE2插入內質網[5]。甲病毒的Cap蛋白N端結構域雖保守性較低，富含正電荷。Cap蛋白存在核定位信號和核出口信號位點，在核胞質運輸中發揮作用[18]。而Cap蛋白的C端蛋白酶結構域高度保守，Cap蛋白的114～264殘基表面存在疏水區域，并被譽為疏水口袋。該口袋能與E2蛋白C端的16個殘基相互作用[19]，該結合在甲病毒組裝中發揮積極作用。

目前，國內外對于GETV的E2蛋白研究主要是基于原核表達E2蛋白并建立ELISA方法[20- 21]，而對于其抗體制備報道較少。E2與Cap蛋白抗體對研究GETV蛋白的功能起著重要的作用。姜焱等[22]成功制備了GETV的Cap蛋白多抗，但沒有進一步驗證Cap多抗與GETV的反應性。GETV的Cap蛋白與E2蛋白多抗不僅能應用于分離鑒定GETV，還能應用于流行病學調查。為深入了解GETV，本文制備了其鼠源Cap多抗與E2多抗，Western blot和IFA均證實此2種多抗均能特異性識別GETV，為進一步探究GETV致病機制提供了物質基礎。