DHA對人牙齦成纖維細胞生物學活性及炎癥因子表達的作用

孫夢君，周可聰，夏一如，謝玉峰，束 蓉

牙周炎是口腔常見的慢性感染性炎癥性疾病，可造成牙周軟硬組織破壞，引起牙齒松動脫落。菌斑生物膜是引起牙周炎的始動因子，宿主過度的免疫炎癥反應在疾病進展中也發揮重要作用[1-2]。

牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是牙周主要致病菌，可與其代表性毒力因子脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)激活一系列信號通路，誘導牙周組織中多種炎癥因子的釋放[3-4]。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)屬于n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs)，具有多種生物學功能，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等[5-7]。

人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGFs)是牙齦中的主要組成細胞，在受到牙周致病菌及其毒力因子刺激后，可釋放一系列促炎介質，加重炎癥反應[8-9]。

本研究擬觀察DHA對HGFs生物學活性的影響及P.gingivalisLPS、熱滅活P.gingivalis作用下HGFs炎癥因子(IL-6、IL-8、IL-1β)的表達變化，為DHA在牙周炎防治方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM高糖培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，DHA(Cayman，美國)，活死細胞染色試劑盒(Biovision，美國)，P.gingivalisLPS(Invivogen，美國)，RNAiso Reagent、Prime ScriptTMRT reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTM(寶生物，中國大連)，IL-6、IL-8、IL-1β ELISA試劑盒(西唐，中國上海)，HO-1、β-actin抗體(Abcam，英國)。

1.2 HGFs細胞培養

本研究經上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會批準(批件號：2016-210-T159)，所有患者知情同意。實驗獲取上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院牙周病科門診患者的牙齦組織，均為牙周健康患者經牙冠延長術及牙齦切除術后切除，并將牙齦組織即刻置于含有雙抗的DMEM中保存。采用倒置組織塊法培養原代細胞，待從組織塊中爬出的細胞密度為70%～80%時進行傳代培養，選取第4～6代細胞用于后續實驗。

1.3 觀察細胞生物學活性

1.3.1 活死細胞染色 將細胞接種至24孔板，接種密度為1×105個/mL，培養24 h后，換用空白培養液(對照組)或含不同濃度DHA(100、200 μmol/L)的培養液繼續培養48 h。根據染色試劑盒說明書進行活死細胞染色，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.2 細胞形態觀察 光鏡：將細胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養24 h后，換用空白培養液(對照組)或含100 μmol/L DHA的培養液繼續培養48 h，采用光學顯微鏡觀察細胞形態并拍照。

熒光顯微鏡：將細胞以5×104個/mL密度接種至置有細胞爬片的24孔板，培養24 h后，換用空白培養液(對照組)或含100 μmol/L DHA的培養液繼續培養48 h；采用4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，0.1% Triton X-100處理10 min，PBS洗3次；1% BSA封閉1 h，PBS洗3次；100 nmol/L FITC-鬼筆環肽避光處理2 h，PBS洗3次；1∶1 000稀釋的DAPI避光孵育5～10 min，PBS洗3次；采用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 細胞周期檢測 將細胞以2.5×104個/mL密度接種至6孔板，培養24 h后，換用不含血清的DMEM培養液饑餓12 h，再換用空白(對照組)或含100 μmol/L DHA的含血清培養液繼續培養24 h及48 h。收集細胞，采用70%乙醇固定，加入碘化丙啶染色液，于37 ℃避光溫浴30 min，24 h內完成流式檢測。

1.4 觀察IL-6、IL-8、IL-1β基因及蛋白表達

1.4.1P.gingivalis的熱滅活處理 收集對數生長期P.gingivalis菌液，調整OD600 nm為1.0，對應細菌濃度為1×109CFU/mL，分裝后置于60 ℃水浴1 h，儲存于-80 ℃備用。

1.4.2 定量PCR檢測 將細胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養24 h后，換用空白培養液或含不同濃度DHA(25、50、100 μmol/L)的培養液預處理2 h，再換用空白培養液(對照組)或含P.gingivalisLPS(1 μg/mL)、熱滅活P.gingivalis(MOI=100∶1)的培養液，繼續培養4 h后，采用Trizol裂解細胞，提取總RNA，逆轉錄獲得cDNA，熒光定量PCR檢測。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。定量PCR引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4.3 ELISA檢測 將細胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養24 h后，換用空白培養液或含不同濃度DHA(25、50、100 μmol/L)的培養液預處理2 h，再換用空白培養液(對照組)或含P.gingivalisLPS(1 μg/mL)、熱滅活P.gingivalis(MOI=100∶1)的培養液，繼續培養24 h后，收集細胞上清。按照ELISA試劑盒說明書進行IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白檢測。

1.5 檢測HO-1基因及蛋白表達

1.5.1 檢測HO-1基因 HO-1基因定量PCR檢測步驟同1.4.2，基因引物序列F：GCAGAGGGTGATAGAAGAGGC，R：GTGTAAGGACCCATCGGAGAA。

1.5.2 Western blot檢測 將細胞以1×105個/mL密度接種至6孔板，培養24 h后，換用空白培養液(對照組)或含不同濃度DHA(25、50、100 μmol/L)的培養液預處理2 h，采用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。采用10% SDS-PAGE分離蛋白質并轉至0.22 μm孔徑的PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。孵育HO-1、β-actin一抗，4 ℃過夜。TBST洗膜后，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后，采用ECL試劑顯色并成像。

1.6 統計分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，定量資料以平均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 DHA對HGFs細胞活性的影響

活死細胞染色顯示，DHA濃度為100 μmol/L時，紅色熒光染色的細胞數與對照組相比未見改變，但當DHA濃度達到200 μmol/L時，紅色熒光染色的細胞數明顯增加，表明細胞活性下降(圖1)。根據該結果，后續實驗中DHA最高濃度采用100 μmol/L。

圖1 DHA對HGFs細胞活性的影響(活死細胞染色)( ×100)

2.2 DHA對HGFs細胞形態的影響

光學顯微鏡(圖2B)及熒光顯微鏡(圖2D)觀察顯示，HGFs在100 μmol/L DHA處理48 h后，細胞形態與對照組(圖2A、C)相比未見明顯改變。

A：對照組，光學顯微鏡( ×100)；B：DHA 100 μmol/L處理組，光學顯微鏡( ×100)；C：對照組，熒光顯微鏡( ×400)；D：DHA 100 μmol/L處理組，熒光顯微鏡( ×400)

2.3 DHA對HGFs細胞周期的影響

流式細胞術檢測表明，與對照組相比，100 μmol/L DHA處理HGFs 24 h和48 h后，G0/G1、S和G2/M期細胞所占比例均未發生明顯改變，差異無統計學意義(P>0.05)(圖3A)，代表性的流式圖見圖3B。

A：細胞周期統計圖；B：代表性的流式代表圖

2.4 DHA對P.gingivalis LPS及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs表達IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影響

定量PCR結果顯示，25、50、100 μmol/L DHA預處理均可顯著下調P.gingivalisLPS誘導HGFs表達的IL-1β mRNA及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs表達的IL-6、IL-8和IL-1β mRNA(P<0.05)，且隨著DHA濃度的增加，其抑制效果逐漸增強(圖4C～F)；100 μmol/L DHA還可明顯下調P.gingivalisLPS誘導表達的IL-6和IL-8 mRNA(P<0.05)(圖4A、B)。

A～C：DHA對P.gingivalis LPS誘導細胞表達IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影響；D～F：DHA對熱滅活P.gingivalis誘導細胞表達IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的影響；*：與LPS組、滅活全菌組相比，P<0.05

2.5 DHA對P.gingivalis LPS及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs表達IL-6、IL-8、IL-1β蛋白的影響

ELISA結果顯示，25、50、100 μmol/L DHA預處理均可顯著下調P.gingivalisLPS誘導HGFs分泌的IL-6蛋白及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs分泌的IL-6和IL-8蛋白(P<0.05)，且隨著DHA濃度的增加，其抑制效果逐漸增強(圖5A、C、D)；100 μmol/L DHA還可明顯下調P.gingivalisLPS誘導分泌的IL-8(P<0.05)(圖5B)。

A、B：DHA對P.gingivalis LPS誘導細胞表達IL-6和IL-8蛋白的影響；C、D：DHA對熱滅活P.gingivalis誘導細胞表達IL-6和IL-8蛋白的影響；*：與LPS組、滅活全菌組相比，P<0.05

而對于IL-1β蛋白，ELISA檢測中各組樣品的光密度值均低于標準曲線的最小光密度值，因此，未檢測出其表達。

2.6 DHA對P.gingivalis LPS及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs表達HO-1 mRNA的影響

定量PCR檢測發現，25、50、100 μmol/L DHA預處理HGFs后，均可顯著上調P.gingivalisLPS及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs表達的HO-1 mRNA(P<0.05)，且其上調作用呈濃度依賴性(圖6)。

A：DHA對P.gingivalis LPS誘導細胞表達HO-1 mRNA的影響；B：DHA對熱滅活P.gingivalis誘導細胞表達HO-1 mRNA的影響；*：與LPS組、滅活全菌組相比，P<0.05

2.7 DHA對HGFs表達HO-1蛋白的影響

Western blot結果顯示，25、50、100 μmol/L DHA均可顯著上調HGFs表達的HO-1蛋白(P<0.05)(圖7)。

*：與對照組相比，P<0.05

3 討 論

DHA是n-3 PUFAs的代表性成員之一，具有22個碳原子和6個不飽和雙鍵，其不飽和雙鍵起始于碳氫鏈甲基端的第3和第4碳原子之間。人體自身并不能有效合成DHA，僅能通過攝入深海魚類及魚油補充。DHA具有多種生物學功能，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等，并且不會產生明顯的抗藥性[5-7,10-11]。

目前關于DHA抗炎作用的研究主要集中于免疫細胞[11]，其對牙周組織細胞的作用僅見于人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament cells，HPDLCs)。我們前期研究發現：DHA對牙周致病菌及其生物膜具有顯著的抑制作用[12]，可在不影響細胞活性的前提下顯著抑制P.gingivalisLPS誘導HPDLCs表達的炎癥因子，包括白介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8及IL-1β[12-13]。

HPDLCs是牙周膜中的主要細胞，而牙周炎癥初期主要累及牙齦組織，HGFs作為牙齦組織中的主要組成細胞，在牙周炎癥初期發揮作用。DHA對HGFs生物學活性及炎癥因子表達的作用尚不得而知，本研究就此進行了探討。

研究表明，高濃度DHA可顯著抑制腫瘤細胞及正常細胞的活性。當DHA濃度≥228 μmol/L，可呈劑量依賴性抑制胃癌細胞生長，可能與DHA誘導細胞凋亡有關[14]。同樣，100 μmol/L DHA可明顯抑制前列腺癌細胞系增殖，并誘導細胞凋亡[15]。對于人內皮細胞系，DHA從200 μmol/L開始顯著下調細胞活性[16]。而50、100 μmol/L DHA對人內皮細胞系及小鼠成肌細胞系的細胞活性無明顯影響[16-17]。同樣，本實驗前期采用MTT檢測發現，25、50、100 μmol/L DHA并不影響HPDLCs及HGFs的細胞活性，但200 μmol/L DHA則使細胞活性顯著下降[10,12-13]。在前期實驗基礎上，本研究進一步采用活死細胞染色觀察發現，當DHA濃度達到200 μmol/L時，可明顯抑制HGFs活性，而100 μmol/L DHA則不影響細胞活性，與課題組前期MTT結果一致[10,12-13]，這為DHA的臨床應用提供了濃度選擇方面的理論依據。

目前DHA對細胞周期的作用研究較少。DHA可呈濃度依賴性上調成肌細胞系[17]及乳腺癌細胞[18]G0/G1期，下調S期和G2/M期細胞比率。與上述結果不同，100 μmol/L DHA并不會改變乳腺癌細胞G0/G1期、S期及G2/M期細胞比率[19]。我們的研究結果也未發現100 μmol/L DHA對HGFs各細胞周期比例的改變。上述研究結果的不一致，可能是由于不同的細胞間脂肪酸的多樣性所致[17]。

DHA對多種炎癥介質具有明顯的抑制作用，目前研究多集中于免疫細胞[20-22]。DHA可顯著下調LPS誘導單核細胞表達的IL-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[21]。DHA還可顯著抑制LPS誘導巨噬細胞表達的IL-6和IL-1β[22]。而在牙周防御反應中，除了免疫細胞，牙周組織細胞也發揮了必不可少的作用。我們前期已發現，在25～100 μmol/L濃度范圍內，DHA可呈劑量依賴性下調P.gingivalisLPS誘導HPDLCs表達的IL-6、IL-8和IL-1β[12-13]。在此基礎上，本研究進一步發現，100 μmol/L DHA可顯著抑制P.gingivalisLPS及熱滅活P.gingivalis誘導HGFs表達的IL-6、IL-8、IL-1β mRNA以及IL-6、IL-8蛋白，25、50 μmol/L DHA也表現出不同程度的下調作用。這與DHA對免疫細胞炎癥因子的抑制作用一致[21-22]。

目前，DHA的抗炎機制尚不明確，可能與其誘導HO-1表達有關。對于人內皮細胞系，50 μmol/L和100 μmol/L DHA可上調其HO-1表達，而通過siRNA抑制HO-1后，DHA對炎癥因子的抑制能力減弱[16]。同樣，DHA可上調小鼠腹膜巨噬細胞HO-1的表達，可能與其下調IL-6、IL-1β和TNF-α有關[23]。我們在本研究中也發現DHA可顯著上調HO-1表達，該上調趨勢與其對炎癥因子的抑制趨勢相反，提示HO-1可能在DHA對HGFs的抗炎效果中發揮作用。為了進一步明確HO-1的作用，有待將其抑制或敲除后進一步觀察DHA抗炎效果的變化來加以證實。

綜上所述，DHA可在不影響HGFs生物學活性的前提下，有效抑制牙周致病菌及其毒力因子誘導細胞表達的炎癥因子，該抑制作用可能與DHA對HO-1的上調作用有關，提示DHA用于牙周炎防治的潛在可能。