川續斷皂苷Ⅵ對小鼠成肌細胞成骨分化的影響

朱 珠，張 瑋

骨質疏松癥是一種常見的骨骼疾病，常發生于老年人、絕經后或雌激素缺乏的婦女，其主要特點是骨重建率高，骨吸收率高于骨形成率[1]。骨質疏松癥增加了骨折的風險，并可能導致高昂的醫療費用，該病的防治越來越受到重視。目前對這種疾病的治療主要是藥物治療，如降鈣素、雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調節劑和人單克隆抗體[2-5]。然而，這些藥物的使用增加了頜骨骨壞死、中風和癌癥的風險[6-7]。因此，有必要尋找更安全、更有效的抗骨質疏松藥物。

間充質干細胞是一種多能干細胞，具有分化成各種組織的潛能，如成骨細胞，通常從骨髓和骨外間充質中分離出來。小鼠成肌細胞(C2C12)就是其中一種，因其在體內分布廣泛、易于獲得而常被用作研究骨外間充質細胞向成骨細胞分化的模型細胞系[8-9]。

從植物中提取的天然化合物是潛在的抗骨質疏松藥物的資源。川續斷是多年生草本續斷的干根，生長在我國濕潤的田野和山區，是我國長期安全使用的補腎中藥，用于治療骨折和關節疾病[10]。川續斷皂苷Ⅵ(Asperosaponin Ⅵ，ASA Ⅵ)是川續斷最主要的生物活性成分，具有多種有益的特性，包括神經保護、預防骨質疏松、預防心肌梗死、抗凋亡和鎮痛等[11-13]。然而，到目前為止，還沒有關于ASA Ⅵ對C2C12細胞成骨作用的報道，因此本研究試圖采用C2C12細胞作為研究模型來探討ASA Ⅵ對其的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

ASAⅥ(純度>99%，中國藥品生物制品檢定所)溶解在二甲基亞砜溶液(DMSO)中，并在-20 ℃下儲存。DMEM培養基，抗壞血酸磷酸酯、β-甘油磷酸酯、地塞米松和茜素紅(Sigma公司，美國)，胎牛血清(FBS)(Invigentech，美國)，Trizol試劑(諾唯贊生物科技有限公司，南京)，細胞計數試劑盒8(CCK-8)(新賽美公司，蘇州)，ALP活性試劑盒(建成，南京)，BCA蛋白質分析試劑盒(碧云天，上海)，PVDF膜(Millipore，德國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和成骨分化 C2C12細胞購自美國菌種保藏中心(ATCC，美國)。細胞在含有10% FBS和1%青霉素和鏈霉素(碧云天，上海)的DMEM中培養，放入5% CO2、37 ℃的培養箱孵育。成骨培養基(1 mmol/L地塞米松、1 mol/L β-甘油磷酸和10 mmol/L L-抗壞血酸)誘導成骨分化。

1.2.2 細胞活力測定 細胞接種在96孔板中，密度為1×103個細胞/孔。每孔含100 μL培養基，37 ℃孵育。24 h后，用不同劑量的ASA Ⅵ(0、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)處理細胞，每個濃度設置3個復孔，對照組用DMSO處理。培養1、2、3 d后，使用CCK-8測定細胞活力。在450 nm處用分孔分光光度計測定吸光度。每次實驗均重復3次。

1.2.3 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測定 將細胞與不同濃度的ASA Ⅵ(0、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-8mol/L)一起接種在24孔板(2×103個細胞/孔)中，每個濃度設置3個復孔。在成骨誘導4 d或7 d后，用0.2%Triton X-100(碧云天，上海)在冰上裂解細胞，然后在4 ℃條件下，以14 000 r/min離心15 min。收集上清液，使用ALP活性試劑盒檢測ALP活性，并使用BCA蛋白質分析試劑盒測量蛋白質濃度，篩選出促進C2C12細胞成骨分化的最佳作用濃度。

1.2.4 茜素紅染色 將細胞接種在含有或不含ASA Ⅵ(促ALP活性的最佳作用濃度)的成骨培養基中，每3 d換1次培養基。到第7天時，細胞用PBS洗滌兩次，用98%乙醇固定20 min。然后，再次用PBS洗滌，每孔加入適量茜素紅溶液，37 ℃孵育15 min，鏡下拍攝鈣結節。

1.2.5 實時定量PCR檢測 采用實時PCR檢測顯著的成骨分化相關標記基因，包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(Ocn)、1型膠原α1(Col1α1)和Runt相關轉錄因子2(Runx2)的表達水平。將細胞接種于6孔板(4×104個細胞/孔)和ASA Ⅵ(促ALP活性的最佳作用濃度)的成骨培養基中，每個濃度設置3個復孔。在成骨誘導7 d后，使用Trizol試劑提取總RNA，對ALP、Ocn、Col1α1和Runx2進行cDNA合成。β-actin作為內參。

1.2.6 免疫印跡分析 如前所述，成骨誘導條件下培養7 d后，用PBS洗滌3次，用RIPA緩沖液(碧云天，上海)在冰上裂解，然后在12 000 r/min離心5 min。收集上清液，并使用BCA蛋白質分析試劑盒測定蛋白質濃度；50 μg蛋白質煮沸10 min，通過SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。在TBST緩沖液中用5%BSA封閉膜，在4 ℃下與一級抗體孵育過夜。在TBST中洗滌膜3次15 min，并在室溫下與二級抗體孵育30 min。用曝光機測定實驗帶的吸光度值與β-actin吸光度的關系。

1.3 統計與方法

所有實驗均至少重復3次，用單因素方差分析比較各組間的差異。P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結 果

2.1 ASA Ⅵ對C2C12細胞增殖的影響

ASAⅥ誘導1、2和3 d后，1×10-3、1×10-4mol/L組明顯抑制細胞增殖，對細胞有一定的毒性(P<0.01)，而1×10-8～1×10-5mol/L組則對細胞增殖均無明顯作用(P>0.05)(圖1)。

**：P<0.01

2.2 ASA Ⅵ對C2C12細胞ALP活性的影響

研究發現1×10-8～1×10-5mol/L均能促進細胞分化，但其中1×10-6mol/L促進細胞分化的效果最為明顯(P<0.01)(圖2)。因此后續以1×10-6mol/L為最佳促分化濃度進行實驗。

*：P<0.05；**：P<0.01

2.3 ASA Ⅵ對C2C12細胞礦化的影響

采用茜素紅染色法檢測了ASA Ⅵ對C2C12細胞鈣結節沉積的影響(圖3)。與對照組相比，1×10-6mol/L組中紅色標記的礦化結節數量顯著增加(P<0.05)。這些數據表明，ASA Ⅵ增強了C2C12細胞的鈣沉積。

A：對照組細胞鈣結節沉積(肉眼觀)；B：1×10-6 mol/L ASA Ⅵ組細胞鈣結節沉積(肉眼觀)；C：對照組細胞鈣結節沉積(茜素紅染色 ×10)；D：1×10-6 mol/L ASA Ⅵ組細胞鈣結節沉積(茜素紅染色 ×10)

2.4 ASA Ⅵ對C2C12細胞成骨分化的影響

我們在mRNA和蛋白質水平分別檢測了幾個成骨指標(ALP、Runx2、Ocn和Col1α1)的表達水平。與對照組相比，ASA Ⅵ組的ALP、Runx2、Ocn和Col1α1的表達量均升高(圖4，P<0.05)。這些結果表明，ASA Ⅵ促進了C2C12細胞的成骨分化。

A：PCR結果，*：與對照組相比，P<0.05；**：與對照組相比，P<0.01；B：Western blot結果

3 討 論

隨著年齡的增長，老年人身體機能逐漸退化，其體內骨髓間充質干細胞的數量及成骨分化能力也降低，骨形成顯著減少，最終導致骨質疏松癥[14]。有文獻表明，骨外間充質干細胞在一定條件下，可誘導分化為成骨細胞并發揮功能[15]，并且骨外間充質干細胞數量巨大，取材容易，創傷較小，體外培養傳代增殖能力較強。其引起了組織工程領域的廣泛關注，提供了一條新的成骨細胞的來源。

C2C12細胞是小鼠成肌細胞，起源于未分化的骨外間充質細胞，可誘導分化為成骨細胞。有研究表明，成纖維細胞生長因子21能促進C2C12的成骨分化，表明C2C12有向成骨細胞分化的潛能[16]。在我們的研究中，我們通過茜素紅染色分析發現明顯的鈣結節，這表明C2C12具有向成骨細胞分化的能力，為我們的研究提供了良好的模型。

ASAⅥ是傳統中藥川續斷的主要活性成分之一[17]，藥理作用廣泛。有文獻報道，ASA Ⅵ有較強的抗炎作用，并可用于開發治療疼痛和炎癥相關疾病的藥物[18]；ASA Ⅵ還通過抑制氧化應激誘導的內皮細胞凋亡信號通路，來抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發生，可能是一種潛在的動脈粥樣硬化防治藥物[19]；也有研究發現，ASA Ⅵ對神經元細胞PC12細胞中淀粉樣β誘導的細胞毒性具有神經保護作用[20]，而且ASA Ⅵ不僅可以改善阿爾茨海默癥相關的炎癥，還可以改善記憶障礙[21]；此外，ASA Ⅵ抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的磷酸化，暗示這一途徑可能與ASA Ⅵ的神經保護機制有關[22]。這些研究都表明ASA Ⅵ有較高的研究和開發價值。

在傳統中醫學中，ASA Ⅵ常被用來治療腎臟和骨骼疾病。此前，有文獻報道，ASA Ⅵ可以通過抑制破骨細胞的形成，減輕骨質疏松引起的關節炎[23]。也有研究表明，ASA Ⅵ可促進成骨細胞分化，提高成骨細胞的活性和數量，促進基質鈣化、骨痂生長，從而防止骨質疏松、促進骨折的愈合[24]。綜上所述，ASA Ⅵ既能增加骨形成，同時也能抑制骨吸收。在本研究中，我們發現了高濃度的ASA Ⅵ(如1×10-3、1×10-4mol/L)對C2C12有明顯的毒性作用，而低濃度的ASA Ⅵ對C2C12細胞增殖影響較小，但其卻增強了C2C12的ALP活性，其中效果最佳的濃度是1×10-6mol/L。由于C2C12細胞生長速度較快，盡管我們降低了96孔板的細胞接種密度，但在4～5 d時，細胞仍舊鋪滿整個孔板，且有部分細胞出現了凋亡，所以我們選取了1、2、3 d這幾個時間點來觀察ASA Ⅵ對C2C12細胞增殖的影響。此外，ASA Ⅵ還上調了C2C12中Ocn、Runx2和Col1α1的mRNA和蛋白質水平。綜上所述，我們得出結論，ASA Ⅵ通過誘導ALP、Ocn、Runx2和Col1α1等骨相關蛋白的表達來促進C2C12的成骨分化。

PCR結果顯示，Ocn是其中明顯增長的成骨指標之一。Ocn是成骨細胞分化和骨形成最重要的轉錄因子之一[25]。正常生理情況下，Ocn特異地與羥磷灰石結合，使骨鹽沉積形成羥磷灰石結晶，調整骨礦化沉積速率，調節骨的生長，Ocn促進非結晶的鈣磷鹽向羥磷灰石轉變，調整結晶在膠原上的分布、走向，進而增加骨鹽含量提高骨強度，是成骨細胞的唯一特異性生化指標[26]。本實驗結果顯示1×10-6mol/L ASA Ⅵ作用7 d后，Ocn的表達增加，說明1×10-6mol/L ASA Ⅵ能促進C2C12細胞成骨分化。

目前已有學者證實ASA Ⅵ可以通過PI3K/AKT信號通路誘導骨髓基質細胞成骨分化[13]；還可以通過BMP-2/MAPK/SMAD依賴的Runx2信號通路誘導成骨細胞分化[27]。這些結果表明，一種藥物可以通過多種信號通路協同作用。但是ASA Ⅵ到底是通過何種信號通路促進C2C12成骨分化還未知，仍需后續研究證實。

雖然關于C2C12的潛能和ASA Ⅵ對成骨細胞的作用分別有報道，但ASA Ⅵ對C2C12分化的影響卻鮮有報道。本研究將ASA Ⅵ和C2C12結合起來，發現ASA Ⅵ的加入顯著促進了C2C12的成骨分化，也為治療骨質疏松癥提供了一個新的視角。