DHA對牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導巨噬細胞炎癥的抑制作用

劉艷群，李保勝，李雨陽，劉玉潔，王昊陽，張震陽，孟維艷

種植義齒已逐漸成為牙列缺損或牙列缺失首選的修復方式[1]，但與天然牙相比，種植體周圍的上皮封閉效果欠佳，導致細菌更容易突破上皮屏障，引起深層結締組織甚至骨組織的炎癥，引發種植體周圍炎。在種植體周圍炎的發病過程中，駐留在牙周組織中的巨噬細胞受到病原菌等致病因素的刺激可發生明顯的表型和功能變化[2]。目前，牙齦卟啉單胞菌(Poryromonasgingivlis，P.g)被公認為是引起種植體周圍炎的主要病原體之一[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是P.g細胞外壁的主要成分，主要由脂質和多糖構成，是P.g的主要毒力因子。巨噬細胞在P.g-LPS刺激下，向促炎巨噬細胞表型(M1型)轉化，通過細胞膜表面Toll樣受體4(TLR4)識別LPS，激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路傳導信號，分泌炎性介質如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等募集更多炎癥細胞聚集，并促進破骨細胞分化，引起種植體周圍軟硬組織的破壞[4]。因此巨噬細胞在種植體周圍炎的病理發生過程中充當重要角色，通過減少巨噬細胞向促炎表型極化，抑制炎癥反應有望成為治療種植體周圍炎的重要靶點。

ω-3多不飽和脂肪酸是從深海魚類、海藻中提取出來的天然物質，研究表明其具有抗炎、抗菌、抗腫瘤的作用[5]，被應用于腸炎等菌群失調疾病，此外還能夠改善糖尿病患者的代謝水平[6]。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)是一種人體內無法通過自身合成的ω-3多不飽和脂肪酸，研究表明DHA可以縮短糖尿病患者的傷口愈合時間，減少傷口處促炎型(M1型)巨噬細胞的浸潤[7]。此外DHA可以通過減少LPS誘導的巨噬細胞TNF-α的產生進而抑制破骨細胞的生成,發揮骨保護作用[8]。然而，DHA能否影響P.g-LPS引起的巨噬細胞炎癥反應以及其對種植體周圍炎的作用罕見報道。因此，我們以巨噬細胞模型RAW264.7為研究對象，探究DHA對P.g-LPS誘發巨噬細胞炎癥的調控作用，為DHA治療種植體周圍炎提供前期研究基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

DHA(純度≥98%，編號1704081)(阿拉丁，中國)；小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞(上海中科院細胞所，中國)；HDMEM培養基、PBS、青/鏈霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美國)；P.g-LPS(InvivoGen，美國)；CCK-8試劑盒(碧云天，中國)；ELISA試劑盒(R&D，美國)；細胞RNA提取試劑盒(博麥德，中國)；PrimescriptTMTaKaRa逆轉錄試劑盒、SYBR PrimerScriptTMRT-PCR Kit(Takara，日本)；qRT-PCR擴增儀MX3005P(Agilent，美國)；熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；CO2恒溫細胞培養箱(SANYO，日本)；二甲基亞砜DMSO(北京化工廠，中國)；活性氧檢測試劑盒(萬類生物，中國)。

1.2 DHA的配制

DHA溶解在DMSO中制成100 mmol/L的原液，用培養基稀釋至最終濃度100 μmol/L，確保最終用于后續免疫活性測定實驗的溶液DMSO的含量小于0.1%。

1.3 細胞培養

取-80 ℃凍存的RAW264.7細胞，立即置于37 ℃快速溶解，之后將含有RAW264.7細胞的凍存液轉移到10 mL HDMEM中，1 500 r/min、3 min離心后棄上清，用2 mL含有10%胎牛血清的HDMEM重懸細胞，接種在2個25 mm2培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，每2 d換液1次，取對數期細胞用于后續實驗。

1.4 細胞毒性實驗

將3×103個RAW264.7細胞接種于96孔板中，待細胞貼壁后設置對照組(HDMEM培養基)、P.g-LPS組(1 mg/L)、P.g-LPS+DHA組(25、50、75、100 μmol/L)，每組設3個復孔。對照組細胞正常培養24 h，然后換液繼續用HEDME培養基培養24 h；P.g-LPS組用1 mg/LP.g-LPS預處理24 h，然后用HDEME培養基培養24 h；實驗組分別用終濃度為1 mg/LP.g-LPS預處理24 h，然后分別加入含25、50、75、100 μmol/L 的DHA培養基培養24 h后棄去培養基，每孔加入100 μL HDMEM和10 μL CCK-8試劑孵育2 h，450 nm波長處測定吸光度(D)。

1.5 實驗分組

在六孔板中以2×105個/孔的細胞密度接種RAW264.7，根據上述細胞毒性實驗結果設為5組：對照組(HDMEM培養基)，P.g-LPS組(1 mg/L的LPS可以活化巨噬細胞[9-10])，以及P.g-LPS+DHA組(25、50、75 μmol/L)3個實驗組，每組3個復孔，實驗重復3次。

1.6 實時熒光逆轉錄定量PCR(qRT-PCR)檢測

用RNA快速提取試劑盒提取RNA，于Nano Drop2000分光光度計上檢測RNA濃度，按照PrimescriptTMTaKaRa逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA，按照SYBR PrimerScriptTMRT-PCR Kit說明書聯合熒光定量PCR儀進行擴增和檢測，反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個循環。反應總體系為20 μL，cDNA模板2 μL，無酶水4 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green Master RT-PCR ROXmix1 3 μL。引物見表1，每次擴增以 β-Actin基因為內參，采用相對定量法2-ΔΔct對PCR產物進行分析，比較各組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達。

表1 引物序列及擴增長度

1.7 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測

提取各組細胞上清液，在超速離心機中以2×105r/min離心20 min，按ELISA試劑盒操作步驟分別檢測炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量，在酶標儀波長為450 nm和570 nm的情況下檢測其吸光度，做出標準曲線，計算TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的生成濃度。

1.8 DCFH-DA檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生

在六孔板中以2×105個/孔的細胞密度接種RAW264.7，待細胞貼壁后生長至密度為70%時進行加藥處理。對照組細胞正常培養24 h，然后換液繼續用HEDME培養基培養24 h；P.g-LPS組用1 mg/LP.g-LPS預處理24 h，然后用HDEME培養基培養24 h；實驗組分別用終濃度為1 mg/LP.g-LPS預處理24 h，然后分別加入含25、50、75 μmol/L 的DHA培養基培養24 h將各組細胞上清液棄去，加入PBS清洗2次。分別加入1 mL的DCFH-DA稀釋液(按照1∶1 000用無血清培養基稀釋)混勻，置于37 ℃培養箱內孵育20 min，每隔3 min顛倒混勻。用PBS洗細胞3次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA，熒光顯微鏡下觀察細胞。然后用Image J軟件進行圖像分析，獲得熒光強度總和。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 DHA對P.g-LPS誘導的RAW264.7細胞的毒性作用

①與對照組相比，1 mg/L的P.g-LPS可引起巨噬細胞的增殖，細胞活性增強，但差異不具有統計學意義(P>0.05)。②100 μmol/L的DHA明顯抑制P.g-LPS誘導的RAW264.7細胞的增殖活性(P<0.05)。③≤75 μmol/L的DHA不影響P.g-LPS誘導過的RAW264.7的增殖活性(P>0.05)(圖1)。

A：對照組(HDMEM培養基)；B：P.g-LPS組(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/LDHA組；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA組；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA組；F：P.g-LPS+100 μmol/L DHA組；與P.g-LPS組相比，****：P<0.000 1

2.2 25、50、75 μmol/L DHA對P.g-LPS刺激下RAW264.7細胞內炎性因子mRNA表達的影響

5組炎性因子mRNA表達結果如下：①1 mg/L的P.g- LPS刺激RAW264.7細胞，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達均顯著增高(P<0.05)，證明P.g-LPS誘導體外炎癥模型成功；②75 μmol/L DHA明顯抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(P<0.05)；③25、50 μmol/L DHA均顯著抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表達(P<0.05)，但25、50 μmol/L DHA對IL-1β mRNA的表達均無顯著影響(圖2)。

A：對照組(HDMEM培養基)；B：P.g-LPS組(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA組；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA組；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA組；與P.g-LPS組相比，**：P<0.01，***：P<0.001， ****：P<0.000 1

2.3 25、50、75 μmol/L DHA對P.g-LPS刺激下RAW264.7炎性因子相關蛋白分泌的影響

5組RAW264.7炎性因子相關蛋白分泌結果如下：①1 mg/L的P.g-LPS刺激RAW264.7細胞后，細胞上清液中TNF-α、IL-6的表達均顯著增高(P<0.05)；②25、50、75 μmol/L DHA均明顯抑制TNF-α、IL-6的分泌(P<0.05)；③各組均未測得IL-1β的分泌(圖3)。

A：對照組(HDMEM培養基)；B：P.g-LPS組(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA組；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA組；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA組；與P.g-LPS組相比，****：P<0.0001

2.4 25、50、75 μmol/L DHA對P.g-LPS誘導RAW264.7細胞ROS的影響

ROS檢測結果如下：在免疫熒光顯微鏡下，5組均出現綠色熒光，且各組熒光強度有明顯差異。①對照組僅有少量綠色熒光(圖4A)；②1 mg/LP.g-LPS刺激后RAW256.7細胞內綠色熒光強度明顯增加(圖4B)；③25、50、75 μmol/L DHA組綠色熒光強度減弱，且濃度越高減弱程度越強(圖4C、D、E)。④用ImageJ分析各組熒光強度，結果顯示P.g-LPS組熒光強度明顯增強(P<0.05)，不同DHA組較P.g-LPS組熒光強度明顯減弱，有統計學意義(P<0.05)，并且減弱程度與DHA濃度呈正相關(P<0.05)(圖4F)。

A：對照組；B：P.g-LPS組；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA；D：P.g-LPS +50 μmol/L DHA；E:P.g-LPS +75 μmol/L DHA；F；探針熒光強度與P.g-LPS組相比，****：P<0.0001； DHA組間對比，#：P<0.01

3 討 論

種植體周圍組織的健康與巨噬細胞密切相關，巨噬細胞可以分泌炎癥因子改變種植體周圍的局部微環境，一方面清除外來病原體和細胞碎片，另一方面促進局部炎癥細胞浸潤，損傷種植體周圍的軟硬組織[4]。因此本實驗用種植體主要致病菌P.g的胞外LPS誘導巨噬細胞炎癥模擬種植體周圍的炎癥環境，探究DHA的炎癥抑制作用，以期待從限制種植體周圍巨噬細胞炎癥反應的新視角為種植體周圍炎的防治提供新的方案。

目前DHA是公認存在于腦細胞膜的一種抗炎活性分子，其主要通過直接或間接作用于小膠質細胞減少促炎因子的產生而發揮抗炎作用[11-12]。DHA這種抗炎潛力為其在炎癥性疾病的治療應用中開拓了廣泛前景。Meital等[13]發現DHA可以減少LPS誘導的腹主動脈瘤患者提取的巨噬細胞促炎細胞因子TNF-α和IL-6的表達以及ROS的產生。此外通過系統性補充ω-3多不飽和脂肪酸(富含DHA)可以減輕牙周炎患者探診深度，對牙周傷口的愈合具有積極作用[14]。因此探究DHA對P.g-LPS誘導的巨噬細胞炎癥的抑制作用對后期DHA在牙周炎以及種植體周圍炎的應用具有重要意義。

DHA對細胞的毒性作用具有選擇性，研究表明100 μmol/L的DHA促進骨髓瘤患者外周血提取的單核細胞凋亡，但對從健康人獲取的單核細胞沒有不良反應[15]。本研究通過細胞活力檢測發現≤75 μmol/L的DHA作用濃度不影響P.g-LPS誘導的RAW264.7細胞的增殖活性，差異不具有統計學意義(P>0.05)。100 μmol/L的DHA明顯抑制P.g-LPS誘導的巨噬細胞的增殖(P<0.05)， 該濃度下的DHA作用濃度可能由于其抑制了P.g-LPS誘導過的巨噬細胞的增殖而發揮抗炎作用。為了排除DHA的細胞毒性作用對促炎細胞因子分泌的影響，因此我們呈濃度梯度選擇25、50、75 μmol/L的DHA安全作用濃度用于后續實驗。

種植體周圍炎發生時其周圍組織中巨噬細胞的比例明顯增高，巨噬細胞是急性期免疫反應的應答者，釋放促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6[4]，這些炎性細胞因子又可以作為前體物質誘發后續的炎癥級聯反應[16]，通過信號傳導減少成骨細胞而增加破骨細胞的分化趨向，進而導致種植體周圍的骨質流失[17]。研究發現種植周圍炎部位的牙齦組織和齦溝液中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達較健康部位增高[18]，這與我們構建的體外炎癥模型一致。在P.g-LPS對巨噬細胞無明顯的毒性和無促增殖作用條件下，用1 mg/L的P.g- LPS刺激巨噬細胞后，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達均明顯增高，細胞上清液中TNF-α、IL-6蛋白分泌明顯增加，說明P.g-LPS活化巨噬細胞成功，與先前的LPS誘導巨噬細胞炎癥反應一致[9-10]。而25～75 μmol/L DHA可顯著抑制上述炎癥因子的表達，說明DHA可以通過在mRNA水平上抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表達以及在蛋白水平上抑制TNF-α和IL-6分泌，從而減輕巨噬細胞的過度炎癥反應引起的組織損傷。但是在各組細胞上清液中均未檢測到IL-1β的分泌，我們分析其中原因可能與以下幾個方面有關：①巨噬細胞分泌IL-1β需要LPS的啟動，小鼠比人的巨噬細胞中LPS的刺激作用更明顯[19]，所以可以檢測到IL-1β mRNA的表達，但IL-1β的分泌需要更多的信號(ATP、牙齦蛋白酶)參與[20]，因此在僅存在P.g-LPS的條件下，IL-1β不能正常分泌。②IL-1β缺乏自發分泌的信號序列而需要通過一系列的信號通路完成，P.g-LPS誘導巨噬細胞表達前體IL-1β mRNA，前體IL-1β必須要經過NLRP3炎性小體的修飾才能加工為成熟的IL-1β，進而釋放至胞外[21-22]，而RAW264.7細胞缺乏組裝NLRP3炎性小體的適配器ASC[23]，ASC的缺乏導致前體IL-1β無法轉化為成熟的IL-1β，從而無法分泌到細胞上清液中。Wierenga等[24]在LPS刺激RAW264.7細胞后也未檢測到IL-1β的分泌，與本實驗結果一致。

細菌及其毒力因子透過上皮屏障后與巨噬細胞的TLR4結合，可以誘發細胞內ROS的產生，ROS作為細胞內的第二信使，與炎癥級聯反應存在偶聯，加劇炎癥反應，當ROS大量聚積時，可引起細胞DNA片段化、細胞壞死裂解，增加炎性細胞因子的分泌和炎癥的放大，從而加重細胞和組織損傷[25-26]。因此細胞內ROS的產生可以間接反映炎癥反應程度，本研究發現DHA呈濃度依賴性抑制巨噬細胞內ROS的產生，分析其可能與DHA含有多個雙鍵，能有效還原活性氧的氧化態有關。因此，DHA抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表達的機制可能也與其抑制細胞內ROS的產生有關，但具體機制仍需進一步探究。

綜上所述，高濃度的DHA可以抑制P.g-LPS活化的巨噬細胞的增殖，安全范圍內的DHA可以減少P.g-LPS誘導巨噬細胞內ROS的產生，減少炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達和TNF-α、IL-6的分泌，發揮抗炎抗氧化作用，為后期探索DHA在種植體周圍炎防治方面的應用提供理論依據。