載銀鋅介孔鈣硅納米粒子根管密封性能的研究

李銘銘，周 楊，冷迪雅，王 瑩，吳大明，李 謹

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和儀器

AH-Plus(Dentsply公司，德國)；MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs(Ag∶Zn=1∶1，物質的量比)為課題組前期實驗合成并完成理化性能表征[4]； ProTaper鎳鈦器械(Dentsply公司，瑞士)；牙膠尖(Dentsply公司，瑞士)；電子天平(Sartorius公司，德國)；數顯游標卡尺(SYNTEK公司，中國)；Micro-CT(viva CT 80, SCANCO公司，瑞士)。

1.2 糊劑的理化性能測試

1.2.1 pH值測定 根據產品說明書制備AH-Plus糊劑，常溫靜置干燥，研磨成粉。將100 mg MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs、Ag-Zn-MCSNs和AH-Plus粉末分別放入含20 mL去離子水的離心管中，每組3個標本，37 ℃培養箱中儲存，測量1 h及1、3、5、7、14、21和28 d的溶液pH值。

1.2.3 流動性測定 按照納米粒子∶生理鹽水=2∶1 制備糊劑，將各組糊劑放入1 mL的一次性注射器中，根據ISO 6876-2012(E)推薦的方法測定其流動性(圖1)：擠壓0.05 mL糊劑至潔凈玻璃板中央，(180±5)s后加蓋一塊相同的玻璃板和100 g 砝碼，10 min后去除砝碼，測量材料鋪開的最大徑，重復測量3次取平均值，每組納入10個標本。

A：擠壓0.05 mL糊劑；B：加蓋玻璃板和砝碼；C：測量糊劑鋪開后的直徑

1.3 根管密封性能實驗

1.3.1 樣本收集與制備 在南京醫科大學附屬口腔醫院外科門診收集單根恒牙，去冠，留牙根12 mm，隨機分成5個實驗組(n=30)和2個對照組(n=5)：MCSNs+牙膠尖(gutta percha, GP)組；Ag-MCSNs+GP組；Zn-MCSNs+GP組；Ag-Zn-MCSNs+GP組；AH-Plus+GP組；陽性對照組(GP)；陰性對照組(黏蠟)。

ProTaper預備根管至F3，1%次氯酸鈉沖洗，紙尖吸干。擴大針輸送糊劑至根管并充滿，常規熱牙膠充填。陽性對照組僅用GP不使用糊劑，陰性對照組根管冠方及根尖孔用黏蠟完全封閉。所有標本置于37 ℃培養箱儲存1周。

1.3.2 細菌滲漏測試 設計雙室細菌滲漏模型(圖2)。上室注入1%無菌亞甲基藍染料，下室注入蒸餾水，觀察至染料凝固，若下室中未出現藍色染料則密封性檢測通過，否則予以丟棄。無菌操作臺內紫外燈照射過夜，上下室分別注入0.5、2.5 mL無菌腦心浸液(brain-heart infusion，BHI)培養基，確保根尖3 mm浸沒于BHI中。 37 ℃培養箱培養24 h。若上、下室肉湯保持透明則表明滅菌效果可靠，否則予以丟棄。

A：示意圖；B：實物圖

調節E.faecalis(ATCC 29212)菌液密度為1×108CFU/mL。上室中注入200 μL菌液浸沒根管口，下室中注入2.5 mL無菌BHI培養基至根尖3 mm浸沒，37 ℃培養箱中培養，觀察下室BHI培養基是否渾濁并記錄天數。觀察期為60 d，若60 d內未出現渾濁，則記為未發生滲漏。使用SPSS軟件里的Kaplan-Meier繪制生存曲線。

A：MCSNs；B：Ag-MCSNs；C：Zn-MCSNs；D：Ag-Zn-MCSNs；E：AH-Plus；從左到右依次為距根尖12、8和4 mm 處橫斷面

A：ROI區域；B：圖像二元化(白色區域為充填物)

1.4 統計學方法

利用SPSS 22.0軟件(IBM公司，美國)進行統計學分析，顯著性水平α=0.05。所有數據以平均值±標準差表示，Kaplan-Meier 法分析細菌滲漏結果，Log-rank檢驗和Kruskal-Wallis 檢驗比較抗滲漏百分比和滲漏時間；單因素方差分析和LSD事后檢驗分析Micro-CT結果。

2 結 果

2.1 pH值變化

5組材料28 d內的pH變化情況見圖5。4組納米粒子溶液的pH值均呈堿性。Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs的pH值較 MCSNs 和Ag-MCSNs稍低。AH-Plus的pH值在第28天時穩定于6.2左右，呈弱酸性。

圖5 28 d內納米粒子和AH-Plus的pH值變化曲線

2.2 溶解度與流動性

5組材料的溶解度與流動性見表1。AH-Plus溶解度最低(P<0.05)，4組納米粒子具有較低的溶解度，組間無明顯差異(P>0.05)；4組納米粒子糊劑具有良好的流動性，組間無明顯差異(P>0.05)，但均高于AH-Plus(P<0.05)。

表1 納米粒子和AH-Plus的溶解度和流動性

2.3 細菌滲漏

Ag-MCSNs組滲漏樣本最少，而MCSNs滲漏樣本則最多，但組間差異無統計學意義(P>0.05)；陽性對照組全部樣本48 h內發生滲漏，陰性對照組整個觀察期內未出現滲漏(表2)。 Kaplan-Meier生存曲線圖(圖6)顯示4組MCSNs樣本滲漏主要集中于前2周，之后較為穩定；而AH-Plus組樣本滲漏主要集中于30 d后。

表2 E. faecalis培養60 d后抗滲漏樣本百分比和滲漏時間

M：MCSNs； AH：AH Plus

2.4 Micro-CT分析

5組樣本均顯示了較低的空隙水平(平均2.09%)，組間無顯著性差異(P>0.05)；而根管不同部位的空隙率存在差異(P<0.05)，根尖段最大，其次是根中段和根上段(表3)。

表3 根管不同分段的平均空隙百分比

3 討 論

介孔鈣硅納米材料由于良好的離子釋放特征和豐富的表面活性集團， 已成為納米材料學和納米醫學的研究熱點。本課題組前期通過模板法合成的MCSNs、Ag-MCSNs、Zn-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs均具有典型的介孔結構，比表面積平均300 m2/g[4]，符合納米材料最適載藥比表面積要求(200～350 m2/g)。

本研究發現4種MCSNs溶液觀察期內pH值穩定于10左右，均呈強堿性，而堿性環境與材料的生物相容性、成骨潛能和抗菌性密切相關[8-10]，提示這4種MCSNs 的水溶液均具有抗菌性。溶解度和流動性是影響根管封閉劑臨床性能的重要因素。理論上根管封閉劑的溶解度應不超過3%，根管封閉劑的流動性應不低于17 mm[11]。本研究發現4種MCSNs的溶解度均不超過3%，其低溶解性有助于根管的封閉，提高根管治療的成功率。4種MCSNs糊劑也都顯示出優于AH-Plus的流動性和可操作性，更容易滲透入根管不規則區域和牙本質小管深處。

本研究利用細菌滲漏法評價4種MCSNs作為根管封閉劑的密封性能，結果發現Ag-MCSNs組滲漏樣本數最少，其次是Ag-Zn-MCSNs和AH-Plus組，這與 Antunes 等[12]和Lertmalapong 等[13]的研究結果一致。4組MCSNs的樣本滲漏主要發生于前2周，之后趨于穩定，這可能是因為：①熱牙膠技術產生的熱量影響了糊劑的理化性能，導致其內部不均勻和空隙的產生，引發短期密封性能欠佳；②納米粒子具有良好的牙本質附著能力，Ag-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs持續釋放功能性離子(Ag+、Zn2+)[14]，能殺滅細菌或抑制其生長，阻止細菌滲漏。本研究還發現AH-Plus組樣本滲漏主要集中于30 d后，提示了晚期滲漏趨勢和長期密封性能欠佳，可能因為該材料不與牙本質形成化學結合，凝固時線型的環氧樹脂分子交聯成體型，大量的加成交聯反應可使固化后的樹脂脆性增加[15]，同時根管內微量水分擴散至樹脂基質中，可能使聚合物產生不同程度的溶解和微裂紋，繼而對長期密封性能產生負面影響[16]。

Micro-CT能夠可視化充填材料與牙本質交界面多孔微觀結構，是體外評估根管充填質量的“金標準”[17-18]。本研究空隙分析顯示所有材料均顯示了良好的牙本質附著性和低空隙率，這可能是因為流動性好的封閉劑、合適的牙膠尖以及熱牙膠技術使得規范預備的圓形根管形成微小空隙的均質整體。然而，沒有材料能完全消除空隙，這與Moinzadeh等[19]和Silva等[20]研究一致，提示目前任何一種充填技術和封閉劑都無法完全消除根管內的空隙。

4 結 論

載銀鋅MCSNs糊劑能營造長期穩定的堿性環境，溶解度較低，流動性良好。Ag-MCSNs和Ag-Zn-MCSNs作為封閉劑充填根管顯著減少了E.faecalis滲漏，根管密封性能良好。