柏木醇及其乙酸酯的制備和抗植物病原菌活性研究

王思禹，劉飛，周倩，徐曙，黃申林，羅金岳*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210037；2. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，南京 210014)

柏木油是從柏科或者松科植物中的根、枝干中提取的一種植物精油，具有清甜的柏木香韻[1-2]。我國(guó)是柏木油的主要產(chǎn)地之一，也是其主要出口國(guó)之一[3]。柏木油的主要成分包括柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯以及其他的一些單萜和倍半萜化合物[4-5]。

柏木醇是廣泛存在于柏木油以及杉木油中的一種倍半萜醇[6-7]。近年來(lái)，陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道了柏木醇及其衍生物的生物活性。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，柏木醇對(duì)人體肺癌細(xì)胞具有良好的細(xì)胞毒活性，可引發(fā)肺癌細(xì)胞的自噬和凋亡。鐘雄[9]發(fā)現(xiàn)在低濃度下柏木醇對(duì)許多微生物有很好的抑菌效果，對(duì)真菌類香菇、金針菇、真珠菇及靈芝等也有一定的抑制作用。此外，也有一些研究發(fā)現(xiàn)柏木醇具有解痙攣活性，鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)心血管及促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)等作用[10-12]。乙酸柏木酯是柏木醇系列的一個(gè)重要衍生物，具有強(qiáng)烈的木香以及雪松氣息，香氣穩(wěn)定持久[13]。

目前中國(guó)市場(chǎng)上的農(nóng)藥有80%是化學(xué)農(nóng)藥，其帶來(lái)的環(huán)境問題和糧食安全問題越來(lái)越不容忽視。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有可自然降解、對(duì)環(huán)境污染少、對(duì)非靶標(biāo)生物安全無(wú)害、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，是促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)的理想農(nóng)藥。

筆者研究柏木醇及其衍生物的抗植物病原真菌活性，探究它們作為植物源農(nóng)藥的開發(fā)潛力。先對(duì)柏木油進(jìn)行初步鑒定，研究柏木醇的分離與結(jié)構(gòu)確證；再通過3種方法(醋酸酐?；ā⒍h(huán)己基碳二亞胺法和脲基偶聯(lián)劑法)探討乙酸柏木酯的合成，確定適宜的反應(yīng)條件；進(jìn)一步通過菌絲生長(zhǎng)速率法，研究其對(duì)7種植物病原真菌的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柏木油(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，Sigma-Aldrich公司)，(1-氰基-2-乙氧基-2-氧亞乙基氨基氧)二甲氨基-嗎啉基-碳鎓六氟磷酸鹽(COMU，Sigma-Aldrich公司，99.7%)，7-甲基二元六胍(MTBD，Sigma-Aldrich公司，99.7%)。

液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司，1260-6500 Q-TOF)，核磁共振儀(瑞士布魯克公司，300 MHz)，紅外光譜儀(KBr壓片)(美國(guó)賽默飛公司，Nicolet 380 FT-IR)。

1.2 柏木油化學(xué)成分分析

液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ESI-HRMS)對(duì)柏木油的化學(xué)成分進(jìn)行分析。液相紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為190～400 nm，色譜柱為Zorbax SB-C18，4.6 mm×100 mm×1.8 μm。流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的水溶液。洗脫條件：0～20 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)由60%到100%；20～40 min，保持流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)100%。流速為0.3 mL/min，柱溫35 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧質(zhì)譜(ESI+/MS)，正離子模式；毛細(xì)管電壓為4.0 kV，干燥氣溫度是350 ℃，霧化器壓力為3.5×105Pa。

1.3 柏木醇的提取及結(jié)構(gòu)鑒定

取柏木油500 g置于燒杯中，加入25 mL的95%乙醇，使用磁力攪拌器劇烈攪拌2 min，結(jié)束后在0 ℃下冷凍結(jié)晶12 h。抽濾，將結(jié)晶通過減壓蒸餾純化，收集150～156 ℃餾分(真空度1.1 kPa)，得到柏木醇粗品。以乙醇溶解柏木醇粗品，再重結(jié)晶一次，提高產(chǎn)物純度。通過HPLC-ESI-HRMS定性，以總離子流圖定量(面積歸一法)，進(jìn)一步通過核磁共振以及紅外對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

1.4 乙酸柏木酯的合成及結(jié)構(gòu)鑒定

以分離得到的柏木醇為原料合成乙酸柏木酯，結(jié)構(gòu)見圖1。由于柏木醇是一個(gè)三環(huán)大位阻叔醇，具有很大的空間位阻，反應(yīng)比較困難，嘗試了3種不同的方法進(jìn)行合成，見圖2。產(chǎn)物比移值為0.5薄層色譜展開劑為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=8∶1。

圖1 柏木醇及乙酸柏木酯Fig. 1 Cedrol and cedryl acetate

a)醋酸酐酰化法； b)DCC法；c)脲基偶聯(lián)劑法。圖2 乙酸柏木酯的合成Fig. 2 The synthesis of cedryl acetate

對(duì)合成的乙酸柏木酯，通過HPLC-ESI-HRMS、核磁共振波譜以及紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，以HPLC-ESI-HRMS總離子流圖定量(面積歸一法)。

1.4.1 醋酸酐酰化法

在三口燒瓶中加入1.3 g柏木醇以及0.7 g醋酸酐，使用二甲苯作為反應(yīng)溶劑，磷酸作為催化劑，120 ℃下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，10% NaOH調(diào)節(jié)pH至中性。30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，以飽和食鹽水洗滌有機(jī)相2次，每次20 mL。有機(jī)相以無(wú)水硫酸鈉干燥過夜，干燥結(jié)束后抽濾、減壓除去溶劑。最后以硅膠柱層析，洗脫劑為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=15∶1，分離純化得到產(chǎn)物。

1.4.2 DCC法

在三口燒瓶中加入0.4 g醋酸，以無(wú)水二氯甲烷作為溶劑，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入1.4 g DCC作為脫水劑，冰浴下反應(yīng)5 min，加入DMAP為催化劑，冰浴反應(yīng)30 min，加入1.3 g柏木醇后，冰浴繼續(xù)反應(yīng)5 min，進(jìn)一步35 ℃反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入10 mL水，以30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，以飽和食鹽水洗滌有機(jī)相2次，每次20 mL。有機(jī)相以無(wú)水硫酸鈉干燥過夜，后續(xù)過程同1.4.1。

1.4.3 脲基偶聯(lián)劑法

在三口燒瓶中加入1.3 g柏木醇以及0.4 g醋酸，再加入2.6 g的脲基偶聯(lián)劑COMU以及1.8 g的MTBD，10 mL無(wú)水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑。打開攪拌以及冷凝裝置，室溫反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入10 mL水，反應(yīng)液用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。使用飽和食鹽水洗滌有機(jī)相，每次20 mL，重復(fù)操作2次。將有機(jī)相以無(wú)水硫酸鈉干燥過夜，后續(xù)過程同1.4.1。

1.5 抗植物病原真菌活性測(cè)定

采用菌絲速率生長(zhǎng)法對(duì)柏木醇以及乙酸柏木酯的抗植物病原真菌活性進(jìn)行研究。柏木醇和乙酸柏木酯溶于二甲基亞砜(DMSO)制成10 mg/mL的母液，將馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基加熱融化后室溫放置，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右時(shí)，加入母液使其終質(zhì)量濃度分別為25，50，100，150和200 μg/mL，倒入培養(yǎng)皿中制成含藥平板。以含等體積DMSO的PSA平板為溶劑對(duì)照，PSA空白平板(不加溶劑或者藥液)為空白對(duì)照(排除溶劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響)。將真菌分別接種于PSA平板上，并在25 ℃生化培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。用打孔器在預(yù)培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌碟，接種于各濃度PSA平板上，25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至空白對(duì)照接近長(zhǎng)滿平板，十字交叉法測(cè)量菌落直徑(扣除5 mm菌碟直徑)。

每個(gè)處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次，測(cè)定的7種病原真菌分別是黃瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、水稻紋枯病菌、稻瘟病菌以及枸杞炭疽病菌。

抑制率的計(jì)算見公式(1)：

(1)

1.6 細(xì)胞毒活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)

使用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色(MTT)法測(cè)試柏木醇以及乙酸柏木酯對(duì)人體正常細(xì)胞(HFL1)的毒性。將HFL1接種在96孔培養(yǎng)板上，接種密度為每孔100 μL，含有5 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后，將原培養(yǎng)液替換為含藥培養(yǎng)液，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，向每個(gè)孔中加入10 μL噻唑藍(lán)(5 mg/L，磷酸緩沖液)，37 ℃孵育4 h。孵育結(jié)束后去除原細(xì)胞培養(yǎng)液，向每個(gè)孔中加入100 μL DMSO，振搖5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔洞的吸光度并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(公式(2))，酶標(biāo)儀的檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。陽(yáng)性對(duì)照為紫杉醇，濃度為0.1 mmol/L。設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 mg/L。

(2)

IC50值的計(jì)算見公式(3)：

IC50=lg-1[Xm-i(∑P- 0.5)]

(3)

式中：Xm表示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最大質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)；i表示相鄰兩組質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)；ΣP表示各組生長(zhǎng)的抑制率之和；0.5是經(jīng)驗(yàn)常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柏木醇的分離及鑒定結(jié)果

2.1.1 柏木油中柏木醇的初步鑒定結(jié)果

柏木油化學(xué)成分復(fù)雜，主要成分包括柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯、花側(cè)柏木烯、長(zhǎng)葉烯、羅漢柏木烯等。使用HPLC-ESI-HRMS對(duì)柏木油進(jìn)行初步檢測(cè)分析(總離子流圖見圖3)，證實(shí)該方法可以應(yīng)用于柏木油中主要成分柏木醇的鑒定，其中柏木醇保留時(shí)間為5.54 min(圖3箭頭所示化合物)。

圖3 柏木油總離子流圖Fig. 3 TIC of cedar wood oil

通過質(zhì)譜對(duì)柏木油中的柏木醇進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖4。鑒定了以下的特征MS峰：基峰質(zhì)荷比(m/z)205.196 9，為脫去一個(gè)水得到的[M—H2O+H]+峰；m/z為245.186 2的峰是其[M+Na]+峰。由圖4可初步確證，柏木油中存在柏木醇。但由于柏木醇非常容易失水，所以質(zhì)譜中的分子[M+H]+峰很小，難以被檢測(cè)到。

圖4 柏木醇質(zhì)譜圖Fig. 4 MS of cedrol

2.1.2 柏木油中提取的柏木醇及其結(jié)構(gòu)

采用分餾以及重結(jié)晶的方法從柏木油中成功分離得到柏木醇37.5 g，收率為7.5%。通過HPLC-ESI-HRMS、核磁共振波譜以及紅外光譜對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，再與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，證實(shí)產(chǎn)物為柏木醇。

柏木醇的理化、核磁和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：白色結(jié)晶，產(chǎn)物色譜純度為98.0%；熔點(diǎn)為85～87 ℃；1H NMR(CDCl3，300 MHz)，δ：0.83(3H，d，J=7.08 Hz，CCHCH3)，0.99(3H，s，CHC(CH3)2)，1.25(3H，s，CHC(CH3)2)，1.34(3H，s，CH2CCH3)，1.36～1.91(13H，m，CH或CH2)，3.72(1H，q，OH)；13C NMR(CDCl3，75 MHz)，δ：15.06(C-12)，24.86(C-15)，27.13(C-4)，28.41(C-13)，29.70(C-14)，31.12(C-10)，34.88(C-9)，36.52(C-3)，40.99(C-2)，41.50(C-11)，42.91(C-6)，53.61(C-1)，56.06(C-5)，60.58(C-7)，74.59(C-8)；質(zhì)譜C15H26NaO [M+Na]+理論值m/z為245.187 6，實(shí)際值m/z為245.186 2，C15H25[M-H2O+H]+理論值m/z為205.195 1，實(shí)際值m/z為205.196 9。

1H NMR中，醇羥基上質(zhì)子的化學(xué)位移出現(xiàn)在δ3.72。4個(gè)CH3化學(xué)位移δ分別為0.83(3H，d，J=7.08 Hz，CCHCH3)，0.99(3H，s，CHC(CH3)2)，1.25(3H，s，CHC(CH3)2)，1.34(3H，s，CH2CCH3)，與羥基靠近的CH3受到羥基的影響，化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)。在13C NMR中，各個(gè)碳的化學(xué)位移δ為15.06～74.59。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，目標(biāo)化合物分子離子峰與理論值均吻合，理論值與實(shí)際值誤差在0.5% 以內(nèi)。

柏木醇的紅外譜圖見圖5。由圖5可知，3 340 cm-1處為醇羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，2 958 cm-1處為甲基伸縮振動(dòng)吸收峰，2 885 cm-1處為亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰，1 340～1 465 cm-1處為甲基亞甲基彎曲振動(dòng)吸收峰。

圖5 柏木醇的紅外譜圖Fig. 5 FT-IR spectrum of cedrol

2.2 乙酸柏木酯的合成及結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

2.2.1 乙酸柏木酯的合成

柏木醇作為一個(gè)三環(huán)大位阻高級(jí)叔醇，其酯化是比較困難的，用傳統(tǒng)的酯化方法通常無(wú)法反應(yīng)或者產(chǎn)物產(chǎn)率較低。采用醋酸酐酰化法、DCC法以及脲基偶聯(lián)劑法研究乙酸柏木酯的合成，發(fā)現(xiàn)脲基偶聯(lián)劑能夠在比較溫和的條件下，對(duì)柏木醇進(jìn)行酯化得到乙酸柏木酯，收率為93.0%。

3種方法中，醋酸酐?；ㄐ枰^高的反應(yīng)溫度，并且收率較低，原因可能是在高溫反應(yīng)的過程中，柏木醇不穩(wěn)定，失水成為柏木烯，降低了產(chǎn)物的收率(79.1%)。DCC法需要低溫冰浴，且反應(yīng)過程中容易生成副產(chǎn)物二環(huán)己基脲(DCU)，后處理繁瑣，影響了反應(yīng)的收率(82.2%)。相比之下，脲基偶聯(lián)劑法反應(yīng)條件比較溫和(室溫反應(yīng))，后處理相對(duì)比較簡(jiǎn)單。

2.2.2 乙酸柏木酯的結(jié)構(gòu)

通過HPLC-ESI-HRMS、核磁共振波譜以及紅外光譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。合成乙酸柏木酯與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比HPLC-ESI-HRMS圖譜見圖6，乙酸柏木酯的紅外譜圖見圖7。

圖6 合成乙酸柏木酯與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比HPLC-ESI-HRMS圖譜Fig. 6 HPLC-ESI-HRMS spectrum of synthesized cedryl acetate compared with standard one

圖7 乙酸柏木酯的紅外譜圖Fig. 7 FT-IR spectrum of cedryl acetate

乙酸柏木酯的理化、核磁和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：白色結(jié)晶，產(chǎn)物色譜純度為98.0%；m.p.為43～45 ℃；1H NMR(CDCl3，300 MHz)，δ：0.83(3H，d，J=7.08 Hz，CCHCH3)，0.97(3H，s，CHC(CH3)2)，1.17(3H，s，CHC(CH3)2)，1.57(3H，s，CH2CCH3)，1.94(3H，s，OCCH3)1.30～2.05(12H，m，CH or CH2)，2.39(1H，d，OCCH)；13C NMR(CDCl3，75 MHz)，δ：14.96(C-12)，22.23(C-14)，24.78(C-17)，25.33(C-15)，26.43(C-4)，27.95(C-13)，30.74(C-10)，32.71(C-9)，36.46(C-3)，40.48(C-2)，40.85(C-11)，42.86(C-6)，53.47(C-1)，56.25(C-5)，56.42(C-7)，85.74(C-8)，169.76(C-16)。HRMS：C17H28NaO2[M+Na]+理論值m/z為287.198 2，實(shí)際值m/z為287.197 4；C34H56NaO4[2M+Na]+理論值m/z為551.407 1，實(shí)際值m/z為551.405 5。

由圖7可知，2 990 cm-1為甲基伸縮振動(dòng)吸收峰，2 900 cm-1為亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰，2 871 cm-1為次甲基伸縮振動(dòng)吸收峰，1 725 cm-1為羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，1 374～1 471 cm-1為甲基亞甲基彎曲伸縮振動(dòng)吸收峰。乙酸柏木酯的1H NMR中，可以觀察到乙酰基上的氫信號(hào)δH1.94。在13C NMR中，可以觀察到乙酰基上的碳信號(hào)δC169.76。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，目標(biāo)化合物分子離子峰與理論值均吻合，理論值與實(shí)際值誤差在0.5% 以內(nèi)。

2.3 抗植物病原真菌活性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定柏木醇和乙酸柏木酯的抗菌譜，結(jié)果見表1及表2。測(cè)定了5個(gè)質(zhì)量濃度下的抗真菌活性，測(cè)定對(duì)象包括7種真菌，分別為黃瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、水稻紋枯病菌、稻瘟病菌和枸杞炭疽病菌，活性較好的結(jié)果見圖8。

表1 柏木醇對(duì)植物病原真菌的抑制率Table 1 Inhibition rate of cedrol on plant pathogenic fungi %

表2 乙酸柏木酯對(duì)植物病原真菌的抑制率Table 2 Inhibition rate of cedryl acetate on plant pathogenic fungi %

DMSO，從左至右樣品質(zhì)量濃度依次為25，50，100，150，200 μg/mL。a)柏木醇對(duì)黃瓜灰霉病活性；b)柏木醇對(duì)水稻紋枯病菌活性；c)乙酸柏木酯對(duì)水稻紋枯病菌活性。圖8 化合物的抗植物病原菌活性Fig. 8 Antifungal activity of the compounds

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：柏木醇和乙酸柏木酯對(duì)所測(cè)試的部分植物病原真菌顯示了一定的抑制作用。

柏木醇對(duì)黃瓜灰霉病菌最高抑制率為70.39%(200 μg/mL)，對(duì)水稻紋枯病菌最高抑制率為60.99%(200 μg/mL)，對(duì)油菜菌核病菌及小麥赤霉病菌的最高抑制率也超過了50%，對(duì)枸杞炭疽病菌的活性最差，幾乎沒有活性。當(dāng)柏木醇作用于黃瓜灰霉病菌時(shí)，在低濃度下也具有一定的活性，當(dāng)濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，進(jìn)一步提高柏木醇的濃度其活性不會(huì)增加；柏木醇作用于水稻紋枯病菌時(shí)，在低濃度時(shí)活性不很明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度從50 μg/mL 提高到100 μg/mL時(shí)，活性顯著提高。

與柏木醇相比，乙酸柏木酯對(duì)7種真菌的活性有所降低。對(duì)水稻紋枯病菌有一定的活性(其最高抑制率為46.70%)，且隨著用藥濃度的增加，抑制率也逐步增加，有著較好的線性關(guān)系；對(duì)枸杞炭疽病菌及油菜菌核病菌幾乎沒有活性。說(shuō)明，對(duì)于柏木醇而言，羥基是必要的活性基團(tuán)，乙?；囊霑?huì)造成活性的降低。

對(duì)于植物源化合物的抗植物病原菌活性，已經(jīng)有很多相關(guān)的研究。如曹妍[16]發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯在10 μg/mL時(shí)，對(duì)油菜菌核病菌就有很好的抑制效果，抑制率可達(dá)72.6%。對(duì)于水稻紋枯病菌，小白菊內(nèi)酯的抑制率也達(dá)到了33.6%。郭現(xiàn)翠等[17]發(fā)現(xiàn)吳茱萸次堿的衍生物對(duì)于植物病原真菌活性一般，但對(duì)細(xì)菌性病菌有一定的抑制作用，經(jīng)過修飾的吳茱萸次堿可對(duì)水稻白葉枯病菌達(dá)到81.8% 的活性。與這些已經(jīng)報(bào)道的同類型植物源化合物相比，柏木醇具有對(duì)于某些植物病原菌(如水稻紋枯病菌)更突出的活性，且具備一定的選擇性。因此，該類化合物具備一定的開發(fā)前景以及探索價(jià)值，尤其是進(jìn)一步對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化。

2.4 細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果

細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柏木醇以及乙酸柏木酯對(duì)人體正常細(xì)胞的IC50大于80 μmol/L，證實(shí)柏木醇及乙酸柏木酯對(duì)人體正常細(xì)胞(HFL1)的細(xì)胞毒活性較低，即對(duì)人體正常細(xì)胞幾乎沒有毒性。該結(jié)果證實(shí)柏木醇以及乙酸柏木酯對(duì)于人畜以及其他非靶標(biāo)生物產(chǎn)生影響的可能性較小，具有安全無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了柏木醇以及乙酸柏木酯作為新型無(wú)害的植物源農(nóng)藥的潛力。

3 結(jié) 論

柏木油化學(xué)成分十分復(fù)雜，使用HPLC-ESI-HRMS對(duì)其中的主要成分之一柏木醇進(jìn)行了初步鑒定，通過分餾以及重結(jié)晶的方法對(duì)柏木油中的柏木醇進(jìn)行了分離，得到了純度為98.0%的柏木醇。作為大位阻高級(jí)叔醇，柏木醇的酯化比較困難，筆者使用脲基偶聯(lián)劑以較溫和的條件成功地合成了乙酸柏木酯，采用HPLC-ESI-HRMS、核磁共振以及紅外對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視環(huán)境安全問題，其中尤其引起人們關(guān)注的是化學(xué)農(nóng)藥的大量應(yīng)用帶來(lái)的環(huán)境問題。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，對(duì)環(huán)境影響小的植物源農(nóng)藥迎來(lái)了難得的發(fā)展機(jī)遇。通過菌絲速率生長(zhǎng)法測(cè)定了柏木醇以及乙酸柏木酯的抗菌活性，結(jié)果表明柏木醇具有較好的活性，對(duì)黃瓜灰霉病菌和水稻紋枯病菌抑制效果明顯，乙酸柏木酯在對(duì)水稻紋枯病菌及稻瘟病菌也具有一定的抑制作用。本研究為柏木醇及其衍生物在植物源農(nóng)藥領(lǐng)域的開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。作為世界柏木油產(chǎn)量大國(guó)，我國(guó)柏木油的深加工利用具有廣闊的市場(chǎng)前景，筆者還為柏木油高附加值系列產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的借鑒。