苯乙雙胍通過激活AMPK抑制肝癌細胞增殖、集落形成及侵襲

(中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院腫瘤科，湖南省株洲市412000)

肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，居中國癌癥發病率的第五位[1]，手術是其主要治療手段，但大部分病人發現時已為腫瘤中晚期，喪失了手術機會。即使進行了手術切除、原位肝移植和射頻消融術，由于肝癌的高侵襲性和復發率，其預后仍不理想[2]。近年來研究表明，二甲雙胍除降糖作用外，還具有抗腫瘤作用[3]。苯乙雙胍同為雙胍類衍生化合物，結構上不同于二甲雙胍[4]，抗腫瘤活性也不同于二甲雙胍。苯乙雙胍無需任何轉運蛋白即可通過細胞膜[5]。因此，苯乙雙胍比二甲雙胍有更好的組織生物利用度，其抗腫瘤作用是二甲雙胍的50倍[6]，且苯乙雙胍具有直接抗腫瘤作用[7]，也可增強化療、放療[8]或者靶向治療[9]的療效。目前關于苯乙雙胍在肝癌中作用的報道少見，本文就苯乙雙胍對肝癌細胞增殖、集落形成、侵襲能力的影響，以及其分子機制進行研究，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

苯乙雙胍(中國阿拉丁試劑公司)；p-AMPK兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)；p-mTOR兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)；β-actin兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)；LipofectamineTM2000脂質體(上海碧云天生物科技公司)；siRNA-AMPK(廣州銳博生物科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡-DMI3000B(德國Leica公司)；全自動化學發光圖像分析系統-4600(上海天能科技有限公司)；多功能酶標儀-Synergy HTX(美國BioTeK公司)；人肝癌細胞株Hep-G2由中南大學湘雅醫院贈予；人肝癌細胞株SMMC-7721由湖南師范大學醫學院贈予。

1.2 細胞培養

SMMC-7721、Hep-G2細胞培養在含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養基中，培養箱控制在37 ℃、5% CO2、100%濕度的環境下，3～4天傳代1次。由于苯乙雙胍在兩個細胞系的敏感度不同，故選擇不同的濃度進行后續實驗[10]。

1.3 細胞轉染

由于Hep-G2對苯乙雙胍更加敏感，因此選擇Hep-G2進行轉染實驗。Veiga等[5]研究苯乙雙胍作用于肝癌也同樣選擇的是Hep-G2細胞。取3×105個對數生長期的Hep-G2細胞接種在6孔板中，培養12 h后轉染，利用脂質體2000將無義siRNA及AMPK siRNA轉染細胞，依據轉染siRNA不同分siAMPK組(轉染AMPK siRNA)及siCtrl組(轉染無義siRNA)，轉染5 h后更換為完全培養基，siAMPK序列：5′-AATTACTTCTGGTGCAGCATAGCGG-3′,siCtrl序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 MTT細胞增殖實驗

取8×103個對數生長期的SMMC-7721、Hep-G2、siRNA Hep-G2以及siAMPK Hep-G2細胞接種在96孔板中，置于培養箱中24 h后，用不同濃度的苯乙雙胍(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μmol/L處理SMCC-7721細胞，0、40、80、160、320、640 μmol/L處理Hep-G2細胞)處理72 h，然后吸出培養基，PBS輕柔清洗2遍，每孔中加入50 μL MTT溶液，繼續培養5 h后向每個孔中添加150 μL二甲基亞砜，避光震蕩15 min，酶標儀檢測每孔在490 nm波長處的光密度(OD值)。細胞相對活力=實驗組OD值/對照組OD值，使用Prism軟件繪制MTT曲線。

1.5 克隆實驗

取8×103個對數生長期的SMMC-7721、Hep-G2細胞接種在24孔板的每孔中，置于培養箱中24 h，用不同濃度的苯乙雙胍(SMMC-7721細胞為0、10、20 μmol/L，Hep-G2細胞為0、25、50 μmol/L)處理5～7天，當對照組細胞(苯乙雙胍濃度為0 μmol/L)生長至70%～80%時，取出24孔板，棄去完全培養液，用PBS輕柔清洗2遍，加10%福爾馬林固定3 h，每孔加1 mL 0.1%結晶紫浸染1 h，浸染后用礦泉水緩慢輕柔清洗，倒置在紙上干燥，放入酶標儀中，選擇波長為550 nm進行定量，使用Prism軟件進行統計學分析。

1.6 侵襲實驗

使用侵襲實驗檢測細胞侵襲能力[11]。取對數生長期的4×104個SMMC-7721細胞、8×104個Hep-G2、siRNA Hep-G2以及siAMPK Hep-G2細胞分別混勻在無血清的培養基中，同時加入不同濃度的苯乙雙胍(SMMC-7721細胞為0、100、200 μmol/L，Hep-G2細胞為0、50、100 μmol/L)，接種在小室上室，在24孔板下室加入500 μL完全培養液，常規培養24 h后，將小室上培養液丟棄，用10%多聚甲醛固定3 h，0.1%結晶紫染色5 h。用鑷子將小室放在清水中輕輕洗滌，去除表面結晶紫，用棉簽輕輕拭去上室的細胞。在顯微鏡下采集圖片并計數細胞穿膜數。相對侵襲能力=實驗組穿膜細胞數/對照組穿膜細胞數。

1.7 Western blot法

使用不同濃度苯乙雙胍(0、100、200、400 μmol/L處理SMMC-7721細胞，0、50、100、200 μmol/L處理Hep-G2細胞)處理細胞24 h后收板。向每個孔中加200 μL蛋白裂解液裂解細胞，放置在100 ℃的水浴鍋中加熱10 min，取出備用。隨后制膠、上樣、電泳、轉膜、剪膜、封閉，在4 ℃孵育一抗14～16 h，洗條帶1 h，室溫下孵育二抗1 h，使用TANON機器拍攝，用Image J軟件分析目標條帶的灰度值(蛋白相對表達水平=實驗組灰度值/對照組灰度值)。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 轉染效果鑒定及對AMPK表達影響

結果顯示siCtrl組和siAMPK組AMPK蛋白相對表達量分別是0.94±0.08和0.15±0.07，siAMPK組細胞幾乎無AMPK蛋白表達(P<0.05；圖1)。成功轉染Hep-G2細胞株。

圖1 沉默AMPK后的AMPK蛋白表達

2.2 SMCC-7721和Hep-G2細胞增殖實驗結果

與苯乙雙胍濃度為0 μmol/L相比，SMMC-7721、Hep-G2細胞活力隨苯乙雙胍濃度增高而下降(圖2)。與siAMPK組相比，siCtrl組對苯乙雙胍的抑制作用更為敏感(P<0.05；圖3)。

圖2 細胞增殖實驗結果a為P<0.05，與同細胞苯乙雙胍0 μmol/L比較。

圖3 沉默AMPK對Hep-G2細胞增殖的影響a為P<0.05，與siCtrl組比較。

2.3 SMCC-7721和Hep-G2細胞克隆實驗結果

不同濃度的苯乙雙胍處理Hep-G2和SMMC-7721細胞后，與苯乙雙胍0 μmol/L組比較，苯乙雙胍處理后細胞的集落形成能力明顯下降(P<0.05；圖4)。

圖4 SMMC-7721和Hep-G2細胞克隆實驗結果1、2、3、4、5、6分別為0、10、20、0、25、50 μmol/L的苯乙雙胍組。a為P<0.05，與同細胞苯乙雙胍0 μmol/L組比較。

2.4 SMCC-7721和Hep-G2細胞侵襲實驗結果

與0 μmol/L組比較，苯乙雙胍處理組細胞的侵襲能力明顯下降，但相同濃度苯乙雙胍(100 μmol/L)處理兩個細胞系，Hep-G2侵襲能力下降更為明顯(圖5)。

圖5 SMMC-7721和Hep-G2細胞侵襲實驗結果(結晶紫染色，100×)1、2、3、4、5、6分別為0、100、200、0、50、100 μmol/L的苯乙雙胍組，a為P<0.05，與同細胞苯乙雙胍0 μmol/L組比較。

60 μmol/L苯乙雙胍處理Hep-G2細胞以及沉默AMPK的Hep-G2細胞，如圖6所示。苯乙雙胍處理的siCtrl組與未予以苯乙雙胍處理的siCtrl組相比，侵襲能力下降。苯乙雙胍處理的siCtrl組與苯乙雙胍處理的siAMPK組相比，siAMPK使Hep-G2細胞的侵襲能力較siCtrl組更強，沉默AMPK后，使苯乙雙胍抗侵襲能力下降，但并非完全消失，而是使苯乙雙胍抗侵襲能力減弱(P<0.05)。

圖6 沉默AMPK對Hep-G2細胞侵襲的影響(結晶紫染色，100×)a為P<0.05，與siCtrl組比較。苯乙雙胍濃度為60 μmol/L。

2.5 SMCC-7721和Hep-G2細胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表達情況

與0 μmol/L組比較，苯乙雙胍處理后的肝癌細胞，p-AMPK表達量增加，p-mTOR表達量下降。苯乙雙胍處理后蛋白表達水平與0 μmol/L組比較，差異具有統計學意義(P<0.05；圖7)。

圖7 SMMC-7721/Hep-G2細胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表達情況A為Western blot實驗結果；B、C為蛋白表達柱狀圖。a為P<0.05，與同細胞苯乙雙胍0 μmol/L組比較。

3 討 論

肝癌是癌中之王，惡性程度十分高，發現時往往處于晚期，失去了手術的機會，放療和化療有效率偏低，預后極差，因此尋找治療肝癌新藥物至關重要。苯乙雙胍作為降糖效果優于二甲雙胍的雙胍類降糖藥，因其乳酸毒性而逐漸退出臨床應用[12]。與二甲雙胍相比，苯乙雙胍具有更好的抗癌活性[13]。然而，迄今為止，很少有研究探討苯乙雙胍的抗腫瘤活性。苯乙雙胍能抑制線粒體呼吸鏈復合物I[7]，降低三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成，一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ATP比率增高，最終誘導AMPK激活，進而抑制其下游信號通路蛋白mTOR[14]，抑制肝癌細胞的生長、增殖和侵襲[15]。AMPK作為一種細胞內能量傳感器，負責調節代謝活動[16]。Appleyard等[17]研究表明，AMPK是雙胍類藥物作用的一個關鍵靶點，AMPK在肝臟中被激活。由此可知，苯乙雙胍具有抗腫瘤活性，但很少有研究報道苯乙雙胍與肝癌的關系。

本實驗結果表明，苯乙雙胍可以抑制SMMC-7721和Hep-G2肝癌細胞的活力、集落形成和侵襲能力，且隨著苯乙雙胍的濃度增大，肝癌細胞的活力、集落形成能力以及侵襲能力越低，其中可見Hep-G2細胞系較SMMC-7721細胞系對苯乙雙胍更為敏感。肝癌的特點就是極易發生肝內轉移，導致無法手術，治療效果欠佳[18]，本實驗使用侵襲實驗檢測肝癌細胞SMMC-7721和Hep-G2侵襲能力，發現苯乙雙胍對兩種細胞系的侵襲能力皆起到抑制作用，從而可能抑制肝癌的轉移。AMPK和mTOR是腫瘤代謝中的重要靶點，Sabharwal等[19]發現苯乙雙胍可誘導線粒體功能障礙和分裂，可使代謝向糖酵解轉變，從而使肝癌細胞更容易受到mTOR抑制劑的影響，其研究得知苯乙雙胍與mTOR抑制劑協同激活AMPK，增加ROS的生成和細胞死亡，從而共同抑制肝癌細胞的生長和增殖。本實驗結果也表明苯乙雙胍作用于SMMC-7721和Hep-G2肝癌細胞，可激活AMPK，并抑制其下游通路蛋白mTOR，從而發揮其抗腫瘤作用。為進一步探索是否通過AMPK發揮作用，選擇對苯乙雙胍更為敏感的Hep-G2細胞，進行AMPK沉默。結果表明，siAMPK組細胞增殖能力較siCtrl組明顯增高，苯乙雙胍作用于siAMPK組仍可以抑制細胞的增殖，但相較于siCtrl組抑制減弱。與MTT實驗結果相似，侵襲實驗也證實siAMPK組對苯乙雙胍敏感度較siCtrl組降低，其遷移細胞數較siCtrl明顯增多。由此，進一步證實苯乙雙胍通過激活AMPK發揮作用，但沉默AMPK之后并不能完全抑制苯乙雙胍抗腫瘤作用，表明苯乙雙胍可能通過其他機制共同發揮抗腫瘤作用，例如通過作用于腫瘤干細胞[16,20]、抑制免疫[21]以及誘導細胞凋亡[22]等。除此之外，苯乙雙胍還可以與各種靶向藥物聯合應用作用于腫瘤細胞[23-24]，增加靶向藥物的作用，延緩靶向藥物耐受時間，從而抑制腫瘤的生長、轉移和進展。這可為腫瘤提供一種新的治療方式。

綜上所述，苯乙雙胍抑制SMMC-7721和Hep-G2肝癌細胞的生長、增殖以及侵襲能力，其機制可能與激活AMPK，抑制mTOR有關。本實驗結果為苯乙雙胍未來應用于臨床治療肝癌提供理論基礎，但未與臨床化療、放療以及靶向藥物聯合，未來就其與藥物協同作用的機制尚有待進一步研究，苯乙雙胍有望成為肝癌治療的一種新的藥物。